特异性识别组氨酸标签的纳米抗体制造技术

本发明专利技术属于基因工程领域，具体为针对组氨酸标签的单域重链抗体，其具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，可用于免疫检测、抗原富集纯化等领域。本发明专利技术所提供的氨基酸序列可以作为前体，通过随机或定点突变技术进行改造，能够获得性质(亲和性、特异性、稳定性等)更好的突变体，用来发展进一步用于医药、工业、农业的蛋白质或多肽。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及单域重链抗体技术(又称纳米抗体技术)，以及基因工程抗体技术，特别是针对组氨酸标签的单域重链抗体或多肽。技术背景组氨酸(His)标签，通常由6和组氨酸构成，也称为多组氨酸标签，6×His标签或hexa组氨酸标签。组氨酸标签常融合在目标蛋白的C端或N端，以便于目标蛋白的纯化和检测。组氨酸残基可以在一定的缓冲液条件下特异性结合到几种类型固定的离子上(比如镍，钴和铜)，然后通过更换缓冲液条件而从固定相洗脱，从而实现纯化含有His标签的目标蛋白。His标签是最常用的蛋白标签之一，通过检测His标签即可获知样品中目标蛋白的情况。本专利技术公开了一种可以与His标签特异性结合的单域重链抗体(即纳米抗体，下同)，可用于His标签融合蛋白的纯化及检测。目前市场上已经有针对His标签的单克隆或多克隆抗体用于检测，但单克隆抗体的研发和生产过程及其繁琐和复杂，多克隆抗体来源有限。相比之下，单域重链抗体仅由一个结构域组成，具有耐酸碱、耐高温、特异性高、分子量小和可大规模生产等优点，用单域重链抗体作为配基制备的纯化介质具有可重复使用、无需咪唑洗脱(免除透析操作)等优点，应用前景广阔。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供针对His标签的单域重链抗体，可以被用于制备检测和纯化His标签的试剂和工具。本专利技术提供一个针对His标签的单域重链抗体(即本专利技术特异性识别组氨酸标签的纳米抗体，下同)，具有SEQ ID NO.:1所示的氨基酸序列。其氨基酸序列的IMGT编号和结构域的划分包括四个框架区(Framework region,FR)和三个互补决定区(Complementarity-determining region,CDR)。本专利技术提供一个核酸分子，其特征是编码SEQ ID NO.:1，通过遗传密码子可以随时获得该核酸分子的具体序列。本专利技术还提供一个核酸分子，其特征是编码SEQ ID NO.:1部分结构域，通过遗传密码子可以随时获得该核酸分子的具体序列。可以为SEQ ID NO.:2核酸分子。本专利技术所提供的核苷酸序列或者至少部分序列可以通过合适的表达系统进行表达以得到相应的蛋白质或多肽。这些表达系统包括细菌，酵母菌，丝状真菌，动物细胞，昆虫细胞，植物细胞，或无细胞表达系统。本专利技术还提供一种载体，包含所述核酸序列。由于遗传密码子具有简并性，该核酸序列可以根据不同的应用目的而不同。本专利技术还提供一种宿主细胞，包括所述蛋白质或表达载体。本专利技术还提供一种检测His标签的方法，含有本专利技术所述针对His标签的单域重链抗体。基于本专利技术提供的针对His标签的单域重链抗体与His标签特异性结合的能力，建立His标签的检测方法。其中，优选的方法包括酶联免疫吸附法(Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)，荧光免疫法(Fluoroimmunoassay,FIA)，免疫芯片法，亲和层析法和免疫层析法等。本专利技术所提供的氨基酸序列可以作为前体，通过随机或定点突变技术进行改造，能够获得性质(水溶性、稳定性、亲和力以及特异性等)更好的突变体，该突变体能与组氨酸标签特异性结合。本专利技术还涉及前述针对His标签的单域重链抗体在免疫检测、富集以及纯化中的应用。这些免疫检测指的是非疾病诊断治疗目的的免疫检测。本专利技术还涉及针对组氨酸标签的免疫亲和吸附材料，包括载体，搭载在载体上的配基，其特征在于该材料以针对组氨酸标签的纳米抗体作为配基，所述针对组氨酸标签的纳米抗体具有SEQ ID NO.:1所示的氨基酸序列。载体材料不限于琼脂糖凝胶，也可以选用硅球、纳米磁珠等。本专利技术所叙述的一些术语具有如下含义：结构域：蛋白质三级结构的基本结构单位，通常具有一定的功能。IMGT编号：IMGT数据库(The International ImMunoGeneTics Datbase)中的一种已经标准化的抗体氨基酸序列编号方法。具体编号方法可以参考文献(Ehrenman,F.,Q.Kaas,et.al.(2010).IMGT/3D structure-DB and IMGT/DomainGapAlign：a databaseand a tool for immunoglobulins or antibodies,T cell receptors,MHC,IgSF and MhcSF.Nucleic Acids Res 38(Database issue):D301-307.Lefranc,M.P.,C.Pommie,et al.(2003).IMGT unique numbering for immunoglobulin and T cell receptor variable domains and Igsuperfamily V-like domains Dev comp Immunol 27(1):55-77.)中的描述。密码子(codon)：又称为三连体密码子(triplet code)，指对应于某种氨基酸的核苷酸三联体。在转译过程中决定该种氨基酸插入生长中多肽链的位置。具体实施方式下面通过单域重链抗体(多肽)的制备、分析及应用，对本专利技术做进一步说明，这些具体实施例不应以任何方式被解释为限制本专利技术的应用范围。实施例1：抗His标签单域重链抗体(即针对His标签的单域重链抗体)免疫文库的构建将6×His标签与牛血清白蛋白(Bovine serum albumin，BSA)共价偶联，得到6×His人工抗原6×His-BSA，取300μg 6×His-BSA与弗氏完全佐剂乳化后，对羊驼(Lama pacos)进行皮下多点注射免疫。加强免疫采用150μg 6×His-BSA与弗氏不完全佐剂乳化，间隔2周进行，每次免疫7天后静脉取血，采用间接ELISA法测定血清效价，选择血清效价最高的样品分离淋巴细胞，提取RNA。RNA的提取参照TAKARA公司RNAiso试剂说明书进行。以RNA为模板，oligo dT为引物，参照TAKARA公司反转录酶说明书合成cDNA第一链。采用PrimeSTAR高保真DNA聚合酶，经巢式PCR获得重链抗体的可变区编码基因(采用的引物见表1)。第一轮PCR分别以引物AlpVh-LD和CH2-R扩增cDNA，反应条件为，98℃，10s，55℃，20s，72℃，1min，20个循环，98℃，10s，68℃，1min，72℃延伸10min。将第一轮PCR产物用1.2％的琼脂糖凝胶电泳，回收600bp～750bp的DNA片段，作为第二轮PCR的模板，分别用引物AlpVh-SfiI和AlpVHHR1-NotI，AlpVh-SfiI和AlpVHHR2-NotI，进行扩增，反应条件为，98℃，10s，50℃，20s，72℃，40s，5个循环，98℃，10s，68℃，40s，30个循环，72℃延伸10min。经DNA片段回收试剂盒回收、定量，于-20℃保存备用。将噬菌粒pHEN1和PCR扩增产物分别用Sfi I、Not I双酶切，经琼脂糖凝胶回收、定量后，以1∶3摩尔比，在16℃，过夜连接。表1文库构建及鉴定所用的引物注：下划线表示限制性内切酶识别序列连接产物经乙醇沉淀后，溶于10μL无菌水，分十次进行电穿孔转化大肠杆菌TG1。取1本文档来自技高网...

【技术保护点】
特异性识别组氨酸标签的纳米抗体，具有SEQ ID NO.:1所示的氨基酸序列。

【技术特征摘要】
1.特异性识别组氨酸标签的纳米抗体，具有SEQ ID NO.:1所示的氨基酸序列。2.一种核酸分子，其特征是编码权利要求1中所述氨基酸序列。3.根据权利要求2所述的核酸分子，其特征在于序列如SEQ ID NO.:2。4.一种包含权利要求2所述的核酸序列的载体。5.一种包含权利要求4所述的载体的宿主细胞。6.权利要求1所述的特异性识别组氨酸标签的纳米抗体在免疫检测、富集纯化组氨酸标签中的应用。7.权利要求1所述的特...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴红静，涂追，付金衡，许杨，
申请(专利权)人：南昌大学，
类型：发明
国别省市：江西;36