【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于将核酸非治疗性(体外)靶向整合到细胞dna中以生成以经标记的形式表达内源蛋白的细胞及其应用的。
技术介绍
1、近年来，crispr/cas技术在自然科学家中迅速普及(1)。尽管早在1987年就在大肠杆菌中发现了crispr基因的功能，但直到很晚之后的2007年才解释了crispr基因的功能(2,3)。2012年，jennifer doudna和emmanuelle charpentier解码了完整的机制，并将其作为现有基因工程工具的一个很好的替代品(4)。2013年，张峰发表了第一篇关于人类细胞中基于crispr/cas的基因组编辑的出版物(5)。
2、研究新的和/或未知的抗原的一个常见问题是缺乏市售的特异性抗体。这使表达或细胞定位方面的表征复杂化。
3、通常，待研究的抗原带有标签并已经在细胞中重组生产。由于表达发生在病毒启动子的控制下，导致抗原的过表达，因此实验通常会产生失真或不正确的数据。
技术实现思路
1、本专利技术的目的是一种新的提供细胞的方法，该细胞例如将药理学上有意义的细胞蛋白作为其与标志物蛋白(即，蛋白质性可检测标记物)的融合蛋白而表达。此类细胞能够研究这种细胞蛋白质以及这种蛋白质直接(即，在其自然环境中)参与细胞中或细胞表面的代谢过程。因此，经标记的蛋白质是在自然条件下从其天然基因座表达的，即，例如，相对于蛋白质的天然表达水平，没有过表达或表达不足，这通常发生在蛋白质作为与标志物的融合蛋白被重组引入细胞的情况下。
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3、因此，本专利技术的目的是新的用于直接在细胞内或细胞表面上研究药学上感兴趣的蛋白质的方法，其中该蛋白质已经在细胞中通过与标志物蛋白融合而在其内源基因座中被修饰。
4、本文所述的专利技术至少部分地基于以下发现：通过使用crispr/cas9技术，可以将蛋白质直接在细胞内与可检测标记物或标签直接在蛋白质的内源基因座处缀合，其中在/可以在经修饰的细胞中获得该蛋白质的天然表达水平。
5、本文所述的专利技术至少部分地基于以下发现：对cas9核酸酶和供体质粒的抗生素介导的双重选择最适合于标志物蛋白(标签)的敲入。
6、本文所述的专利技术至少部分地基于以下发现：与使用线性化形式的供体质粒相比，使用环状构象的供体质粒可以实现显著更高的编辑率。
7、在根据本专利技术的方法中，包含第一抗性盒(例如，嘌呤霉素抗性盒)的cas9编码质粒与作为修复模板的含有第二抗性盒(例如，潮霉素b抗性盒)的环状供体质粒以及合适的合成crrna和tracrrna共转染。选择是对两种抗性的双重选择，例如，潮霉素b用于对供体质粒的抗性，而嘌呤霉素用于对cas9质粒的抗性。
8、本专利技术的一个方面是用于提供/生产表达标志物蛋白与细胞内源靶蛋白的融合蛋白的细胞的(体外)方法，所述细胞内源靶蛋白来自靶蛋白的细胞内源基因座，其中所述方法包括以下步骤：
9、a)用以下项转染所述细胞：i)含有核酸的cas9编码质粒，其赋予对于第一选择试剂的抗性，ii)环状供体质粒，其包含：a)第一核酸，其赋予对于第二选择试剂的抗性，和b)第二核酸，其编码标志物蛋白并且其3'和5'侧翼具有与该细胞整合位点同源的核酸，其中侧翼同源核酸中的一者与靶蛋白的末端编码序列同源，iii)合适的crrna，以及iv)合适的tracrrna，
10、b)在存在第一选择试剂和第二选择试剂的情况下培养细胞，以及
11、c)选择在步骤b)的条件下进行细胞分裂/生长的细胞，从而提供/生产表达标志物蛋白与细胞内源靶蛋白的融合蛋白的细胞。
12、本专利技术的另一方面是一种用于确定/表征抗体对于其靶分子是激动性还是拮抗性(或无活性)的(体外)方法，其包括以下步骤：
13、-任选地确定靶蛋白的生物学活性，
14、-将表达标志物蛋白与细胞内源靶蛋白的融合蛋白并且已经通过根据本专利技术的方法获得的细胞与待测抗体一起孵育，
15、-确定在存在待测抗体的情况下内源靶蛋白的生物学活性如何改变，并且，如果与抗体孵育后生物学活性增加，则将抗体表征为激动性抗体，和/或如果与抗体孵育后生物学活性降低，则将抗体表征为拮抗性的(和/或如果与抗体孵育后生物活性未改变，则将抗体表征为无活性的)。
16、本专利技术的另一方面是用于选择与靶分子特异性结合的抗体的(体外)方法，包括以下步骤：
17、-将表达标志物蛋白与细胞内源靶蛋白的融合蛋白并且已经通过根据本专利技术的方法获得的细胞与一种待测抗体一起孵育或与两种或更多种抗体独立地一起孵育，
18、-确定内源靶蛋白的生物活性在存在待测抗体的情况是否改变，如果生物活性在与抗体孵育时发生改变，则选择该抗体。
19、在一个优选实施例中，用全部质粒和核酸同时转染细胞。
20、在一个实施例中，在步骤c)中，选择进行细胞分裂并且所述细胞中已经检测到融合蛋白的细胞。
21、在一个优选实施例中，步骤b)和步骤c)为以下步骤：
22、b)1)在仅存在第一选择试剂的情况下或在仅存在第二选择试剂的情况下培养细胞，
23、2)选择在步骤1)的条件下分裂/生长的细胞，
24、3)在存在步骤1)中未使用的选择试剂的情况下培养在步骤2)中选择的细胞，
25、c)选择在步骤b)3)的条件下进行细胞分裂/生长的细胞，从而提供/生产表达标志物蛋白与细胞内源靶蛋白的融合蛋白的细胞。
26、在一个实施例中，第一选择试剂和第二选择试剂选自由以下项组成的组：新霉素/g418(新霉素磷酸转移酶)、组氨醇(组氨醇脱氢酶)、潮霉素b(潮霉素磷酸转移酶)、黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶、胸苷激酶、腺嘌呤磷酸核糖转移酶、杀稻瘟菌素、嘌呤霉素、博莱霉素(zeocin)和霉酚酸。在一个优选实施例中，第一选择试剂和第二选择试剂是嘌呤霉素和潮霉素b，反之亦然。
27、在一个优选实施例中，最终潮霉素b浓度为50μg/ml。
28、在一个优选实施例中，最终嘌呤霉素浓度为2μg/ml。
29、在一个实施例中，细胞内源靶蛋白是可溶性蛋白或膜结合蛋白。
30、在一个实施例中，在存在多个用于标志物蛋白(标签)的可能插入位点的情况下，编码标志物蛋白的核酸被插入在含有更多个和/或更具特异性的gdna结合位点的位点处。
31、在一个优选实施例中，细胞为哺乳动物细胞。
32、在一个实施例中，标志物蛋白被c端地或n端地引入到内源靶蛋白。在一个优选实施例中，标志物蛋白编码核酸被n端地直接插入到细胞内源蛋白的起始密码子之后。
33、在一个实施例中，
34、i)所述标志物蛋白被n端地插入到所述靶蛋白，
35、ii)编码所述标志物蛋白的核酸被插入到所述内源基因座中，使得其直接位于本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种用于确定或表征抗体对于其靶分子是激动性还是拮抗性或无活性的体外方法，其包括以下步骤：
2.用于选择与靶分子特异性结合的抗体的体外方法，包括以下步骤：
3.根据权利要求1所述的方法，其中在步骤a)中用全部所述质粒和所述核酸同时转染所述细胞。
4.根据权利要求2所述的方法，其中在步骤a)中用全部所述质粒和所述核酸同时转染所述细胞。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中在步骤c)中选择细胞，所述细胞进行细胞分裂并且在所述细胞中已经检测到所述融合蛋白。
6.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中步骤b)和步骤c)是下述步骤：
7.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述第一选择试剂是嘌呤霉素；以及第二选择试剂是潮霉素B。
8.根据权利要求6所述的方法，其中所述第一选择试剂是嘌呤霉素；以及第二选择试剂是潮霉素B。
9.根据权利要求7所述的方法，其中在步骤b)中或在步骤b)1)和步骤b)3)中，最终潮霉素B浓度为50μg/mL，并且最终嘌呤霉素浓度为2μg/mL。>
10.根据权利要求8所述的方法，其中在步骤b)中或在步骤b)1)和步骤b)3)中，最终潮霉素B浓度为50μg/mL，并且最终嘌呤霉素浓度为2μg/mL。
11.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中在存在多个用于所述标志物蛋白编码核酸的可能插入位点的情况下，编码所述标志物蛋白的核酸被插入在含有更多个和/或更具特异性的gDNA结合位点的位点处。
12.根据权利要求8所述的方法，其中在存在多个用于所述标志物蛋白编码核酸的可能插入位点的情况下，编码所述标志物蛋白的核酸被插入在含有更多个和/或更具特异性的gDNA结合位点的位点处。
13.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述细胞为哺乳动物细胞。
14.根据权利要求6所述的方法，其中所述细胞为哺乳动物细胞。
15.根据权利要求7所述的方法，其中所述细胞为哺乳动物细胞。
16.根据权利要求8所述的方法，其中所述细胞为哺乳动物细胞。
17.根据权利要求11所述的方法，其中所述细胞为哺乳动物细胞。
18.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中
19.根据权利要求6所述的方法，其中
20.根据权利要求7所述的方法，其中
21.根据权利要求9所述的方法，其中
22.根据权利要求11所述的方法，其中
23.根据权利要求13所述的方法，其中
24.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中编码所述标志物蛋白的核酸不包括起始密码子。
25.根据权利要求6所述的方法，其中编码所述标志物蛋白的核酸不包括起始密码子。
26.根据权利要求7所述的方法，其中编码所述标志物蛋白的核酸不包括起始密码子。
27.根据权利要求9所述的方法，其中编码所述标志物蛋白的核酸不包括起始密码子。
28.根据权利要求11所述的方法，其中编码所述标志物蛋白的核酸不包括起始密码子。
29.根据权利要求13所述的方法，其中编码所述标志物蛋白的核酸不包括起始密码子。
30.根据权利要求18所述的方法，其中编码所述标志物蛋白的核酸不包括起始密码子。
31.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述标志物蛋白为荧光标志物蛋白。
32.根据权利要求6所述的方法，其中所述标志物蛋白为荧光标志物蛋白。
33.根据权利要求7所述的方法，其中所述标志物蛋白为荧光标志物蛋白。
34.根据权利要求9所述的方法，其中所述标志物蛋白为荧光标志物蛋白。
35.根据权利要求11所述的方法，其中所述标志物蛋白为荧光标志物蛋白。
36.根据权利要求13所述的方法，其中所述标志物蛋白为荧光标志物蛋白。
37.根据权利要求18所述的方法，其中所述标志物蛋白为荧光标志物蛋白。
38.根据权利要求24所述的方法，其中所述标志物蛋白为荧光标志物蛋白。
39.根据权利要求31所述的方法，其中所述荧光标志物蛋白为绿色荧光蛋白(GFP)。
40.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中3'侧翼同源核酸和5'侧翼同源核酸具有约1000个核苷酸的大小。
41.根据权利要求6所述的方法，其中3'侧翼同源核酸和5'侧翼同源核酸具有约1000个核苷酸的大小。
42.根据权利要求7所述的方法，其中3'侧翼同源...
【技术特征摘要】
1.一种用于确定或表征抗体对于其靶分子是激动性还是拮抗性或无活性的体外方法，其包括以下步骤：
2.用于选择与靶分子特异性结合的抗体的体外方法，包括以下步骤：
3.根据权利要求1所述的方法，其中在步骤a)中用全部所述质粒和所述核酸同时转染所述细胞。
4.根据权利要求2所述的方法，其中在步骤a)中用全部所述质粒和所述核酸同时转染所述细胞。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中在步骤c)中选择细胞，所述细胞进行细胞分裂并且在所述细胞中已经检测到所述融合蛋白。
6.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中步骤b)和步骤c)是下述步骤：
7.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述第一选择试剂是嘌呤霉素；以及第二选择试剂是潮霉素b。
8.根据权利要求6所述的方法，其中所述第一选择试剂是嘌呤霉素；以及第二选择试剂是潮霉素b。
9.根据权利要求7所述的方法，其中在步骤b)中或在步骤b)1)和步骤b)3)中，最终潮霉素b浓度为50μg/ml，并且最终嘌呤霉素浓度为2μg/ml。
10.根据权利要求8所述的方法，其中在步骤b)中或在步骤b)1)和步骤b)3)中，最终潮霉素b浓度为50μg/ml，并且最终嘌呤霉素浓度为2μg/ml。
11.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中在存在多个用于所述标志物蛋白编码核酸的可能插入位点的情况下，编码所述标志物蛋白的核酸被插入在含有更多个和/或更具特异性的gdna结合位点的位点处。
12.根据权利要求8所述的方法，其中在存在多个用于所述标志物蛋白编码核酸的可能插入位点的情况下，编码所述标志物蛋白的核酸被插入在含有更多个和/或更具特异性的gdna结合位点的位点处。
13.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述细胞为哺乳动物细胞。
14.根据权利要求6所述的方法，其中所述细胞为哺乳动物细胞。
15.根据权利要求7所述的方法，其中所述细胞为哺乳动物细胞。
16.根据权利要求8所述的方法，其中所述细胞为哺乳动物细胞。
17.根据权利要求11所述的方法，其中所述细胞为哺乳动物细胞。
18.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中
19.根据权利要求6所述的方法，其中
20.根据权利要求7所述的方法，其中
21.根据权利要求9所述的方法，其中
22.根据权利要求11所述的方法，其中
23.根据权利要求13所述的方法，其中
24.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中编码所述标志物蛋白的核酸不包括起始密码子。
...【专利技术属性】
技术研发人员：A·哈斯，
申请(专利权)人：豪夫迈·罗氏有限公司，
类型：发明
国别省市：
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