一种无抗水产免疫增强剂的制备方法技术

本发明专利技术涉及水产养殖领域，公开了一种无抗水产免疫增强剂的制备方法，包括以下步骤：1）、将80‑120份水产多肽、40‑60份油茶籽粕改性提取物、10‑30份虾青素、10‑30份岩藻黄质、10‑20份珍珠粉、40‑80份海藻提取物、300‑500份水混合均匀，制得组分A；2）、将20‑30份氯化钙溶解于500‑700份水中，制得组分B；3）、将组分A以0.5‑1.5mL/s的速率滴加到组分B中，生产固体沉淀；过滤取固体沉淀，干燥后得到无抗水产免疫增强剂。本发明专利技术的无抗水产免疫增强剂选用纯天然绿色原料，不含抗生素药物，能够有效提高水产养殖动物的免疫能力，且不会对养殖环境造成污染，绿色环保。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及水产养殖领域，尤其涉及一种无抗水产免疫增强剂的制备方法。
技术介绍
近年来，随着水产养殖业快速发展、高密度集约化程度增大，养殖环境恶化、种质资源退化及疾病感染等问题逐年增加，提高水产养殖动物自身免疫能力是抗病的途径之一。目前的提高水产养殖动物免疫力的主要途径是在水产饲料中添加抗生素类药物。但是近年来抗生素等药物滥用情况严重，不仅鱼、虾、蟹类曾经都发生过大面积死亡，而且致使部分水产品中的药物残留量增加或严重超标，严重威胁食品安全。加之欧美日本等主要水产品进口国对水产品的检验日趋严格，也影响了水产品的出口，给我国水产养殖业造成了巨大经济损失。同时药物在水中的积累会对养殖环境造成污染，进一步破坏养殖生态环境，形成恶性循环。因此，从某种意义上讲，增强水产养殖动物自身的免疫力，提高机体的生长性能，减少或停止使用抗生素类药物，提高饲料效率，提高养殖对象品质，已成为水产养殖业的可持续发展的重要瓶颈。
技术实现思路
为了解决上述技术问题，本专利技术提供了一种无抗水产免疫增强剂的制备方法。本专利技术制得的无抗水产免疫增强剂选用纯天然绿色原料，不含抗生素药物，能够有效提高水产养殖动物的免疫能力，且不会对养殖环境造成污染，绿色环保。本专利技术的具体技术方案为：一种无抗水产免疫增强剂的制备方法，包括以下步骤：1）、将80-120份水产多肽、40-60份油茶籽粕改性提取物、10-30份虾青素、10-30份岩藻黄质、10-20份珍珠粉、40-80份海藻提取物、300-500份水混合均匀，制得组分A。2）、将20-30份氯化钙溶解于500-700份水中，制得组分B。3）、将所述组分A装入注射器中以0.5-1.5mL/s的速率滴加到组分B中，生产微溶于水的固体沉淀；过滤取固体沉淀，干燥后得到无抗水产免疫增强剂。将组分A滴加到组分B中后，会交联反应生成球状的固体沉淀，从而将水产多肽、油茶籽粕改性提取物、虾青素、岩藻黄质、珍珠粉等免疫活性成分进行包埋，防止这些免疫活性成分用于饲料添加到水中后溶解流失。本专利技术选用水产鱼类的多肽作为主要的免疫成分，再配以油茶籽粕改性提取物、虾青素、岩藻黄质、珍珠粉等物质，复配成免疫增强剂，添加到水产饲料中被水产养殖动物食用后，能够有效提高水产养殖动物的免疫能力。并且本专利技术的免疫增强剂纯天然，不添加任何抗生素，不仅不会造成动物体内药物残留，并且不会污染水体，绿色环保。作为优选，所述水产多肽选自分子量在1600-4000Da区间的安康鱼多肽、分子量在200-800Da区间的鳕鱼多肽、分子量在600-1000Da区间的金枪鱼多肽。不同鱼类的不同分子量的多肽免疫活性不同，经过本专利技术人的长期研究，发现上述分子量区间的多肽免疫活性较好。作为优选，所述水产多肽的制备方法如下：a、原料解冻清洗：对鱼皮进行流水解冻，解冻时间为2-5h；完全解冻后将鱼皮洗净。b、原料预处理：将鱼皮添加到5-10倍浓度为3-5wt%的氢氧化钠溶液中，在20-30℃下脱脂4-6h，然后取鱼皮用水洗净。c、蒸煮熬胶：将鱼皮在90-100℃下进行蒸煮熬胶8-12h，取生成的鱼皮胶，并对鱼皮胶通过离心处理与油脂分离，离心速率为1000r/min。d、酶解：将鱼皮胶添加到含有中性蛋白酶的酶解液中进行酶解；其中中性蛋白酶的浓度为0.05-0.25wt%，酶解液质量为鱼皮胶质量的2-4倍，酶解温度为30-45℃，酶解液pH至控制在6-8，酶解时间为30-60min。e、炭脱、板框过滤：向酶解液中添加质量为酶解液1-2wt%的活性炭，并将酶解液加热到70-80℃，脱色30-50min；将脱色后的酶解液转移至板框过滤池内进行过滤，取澄清液。f、分离纯化：将澄清液转移至泡沫分离柱中进行鼓气起泡，并收集泡沫液，，在鼓气的同时向泡沫分离柱中注水；鼓气速率为3-5L/min，注水速率为0.1-0.3L/min，泡沫分离柱中液体的装载高度与泡沫分离柱内径比为8-10:1，澄清液温度保持在25-35℃；待收集的泡沫液灭泡后，用离子交换器对泡沫液进行重金属分离；向重金属分离后的泡沫液中添加质量为泡沫液1-2%的磁性亲和微球并分散均匀，静置亲和吸附50-70min后利用磁场使磁性亲和微球聚集；分离出磁性亲和微球后，用pH值为7.2的Tris-HCl缓冲液对磁性亲和微球进行洗脱，再次利用磁场分离出磁性亲和微球后，得到洗脱液，将洗脱液在75-85℃下储存备用。板框过滤后澄清液中的不溶性杂质基本分离完毕，基本只存在溶解性杂质以及重金属离子等。对澄清液进行泡沫分离纯化，由于蛋白物质具有一定的表面活性，能够在液体气泡后聚集在泡沫表面，收集泡沫液，能够将蛋白物质与其他物质进行分离。在泡沫分离过程中，由于泡沫分离柱中水分的不断变少，使得液体中蛋白物质的浓度升高，导致浓度超过临界胶束浓度， 从而容易将其他可溶性杂质附带在泡沫表面，影响分离效果，进行注水能够有效维持液体中蛋白浓度。用离子交换器能够对泡沫液中的一同附着的重金属进行分离，再用磁性亲和微球对泡沫液中的目标蛋白物质进行亲和吸附，使得胶原蛋白肽的纯度更高。g、浓缩：将洗脱液先后输入双效浓缩锅和四效浓缩锅中进行浓缩，制得浓缩液，所述浓缩液的折光度控制在5-6，浓缩后浓缩液在50-60℃下储存。h、膜过滤：将浓缩液通过二级0.22微米膜过滤器进行除杂除菌；其中膜过滤温度小于45℃，一级过滤压力小于0.25MPa，二级过滤压力小于0.4MPa。i、多肽分级：采用超滤膜或纳滤膜对膜过滤后的浓缩液按分子量进行分离，得到目标分子量的水产多肽；j、喷雾干燥：对水产多肽进行喷雾干燥；喷雾温度为80-90℃，喷雾干燥后水产多肽的含水率小于等于5wt%。本专利技术制备的水产多肽，纯度高，得率高，分子量分布区间小，在目标分子量区间内的多肽含量高。作为优选，所述磁性亲和微球由以下方法制得：将海藻酸钠、聚乙二醇、壳聚糖、正庚烷、乙酸、水按质量比2-3:1:2:0.5:3-5:100混合溶解，搅拌均匀后制得混合液A；向混合液A中添加混合液A质量4-6%的四氧化三铁磁粉并分散均匀，得到混合液B；对混合液B进行超声波分散，同时向混合液B中匀速滴加混合液B质量40-60%的乳化液，得到混合液C；先后向混合液C中添加混合液C质量0.1-0.2%的98wt%的戊二醛和混合液C质量0.5-1倍的2.5-3.5wt%的氯化钙溶液，充分搅拌，静置1-2h，生成磁性微球；利用磁场对液体中磁性微球进行聚集，取出磁性微球后进行清洗、干燥；将磁性微球浸泡在水中溶胀15-25min，然后取出磁性微球并添加到活化液中在35-45℃下活化40-80min，磁性微球与活化液的固液比为0.5-1.0g/mL；活化后取出磁性微球并洗净，将磁性微球与肝素按质量比1.5-2.5:1进行混合，得到悬浮液，将悬浮液pH值调节至4-5，然后向悬浮液中添加悬浮液体积1.5-2.5倍的3wt%的1-乙基-3-二甲氨丙基-碳二亚胺，在4℃下静置12-18h;生成磁性亲和微球，最后从悬浮液中取出磁性亲和微球，洗净、干燥，备用。上述方法制得的磁性微球，以四氧化三铁磁粉为磁核，以海藻酸钠、聚乙二醇、壳聚糖为磁核的主要包衣材料，以正庚烷为致孔剂，添加戊二醛和氯化钙溶液后，交联成型，具有多孔性，比表面积大，吸附本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种无抗水产免疫增强剂的制备方法，其特征在于包括以下步骤：1）、将80‑120份水产多肽、40‑60份油茶籽粕改性提取物、10‑30份虾青素、10‑30份岩藻黄质、10‑20份珍珠粉、40‑80份海藻提取物、300‑500份水混合均匀，制得组分A；2）、将20‑30份氯化钙溶解于500‑700份水中，制得组分B；3）、将所述组分A装入注射器中以0.5‑1.5mL/s的速率滴加到组分B中，生产微溶于水的固体沉淀；过滤取固体沉淀，干燥后得到无抗水产免疫增强剂。

【技术特征摘要】
1.一种无抗水产免疫增强剂的制备方法，其特征在于包括以下步骤：1）、将80-120份水产多肽、40-60份油茶籽粕改性提取物、10-30份虾青素、10-30份岩藻黄质、10-20份珍珠粉、40-80份海藻提取物、300-500份水混合均匀，制得组分A；2）、将20-30份氯化钙溶解于500-700份水中，制得组分B；3）、将所述组分A装入注射器中以0.5-1.5mL/s的速率滴加到组分B中，生产微溶于水的固体沉淀；过滤取固体沉淀，干燥后得到无抗水产免疫增强剂。2.如权利要求1所述的一种无抗水产免疫增强剂的制备方法，其特征在于，所述水产多肽选自分子量在1600-4000Da区间的安康鱼多肽、分子量在200-800Da区间的鳕鱼多肽、分子量在600-1000Da区间的金枪鱼多肽。3.如权利要求1或2所述的一种无抗水产免疫增强剂的制备方法，其特征在于，所述水产多肽的制备方法如下：a、原料解冻清洗：对鱼皮进行流水解冻，解冻时间为2-5h；完全解冻后将鱼皮洗净；b、原料预处理：将鱼皮添加到5-10倍浓度为3-5wt%的氢氧化钠溶液中，在20-30℃下脱脂4-6h，然后取鱼皮用水洗净；c、蒸煮熬胶：将鱼皮在90-100℃下进行蒸煮熬胶8-12h，取生成的鱼皮胶，并对鱼皮胶通过离心处理与油脂分离，离心速率为1000r/min；d、酶解：将鱼皮胶添加到含有中性蛋白酶的酶解液中进行酶解；其中中性蛋白酶的浓度为0.05-0.25wt%，酶解液质量为鱼皮胶质量的2-4倍，酶解温度为30-45℃，酶解液pH至控制在6-8，酶解时间为30-60min；e、炭脱、板框过滤：向酶解液中添加质量为酶解液1-2wt%的活性炭，并将酶解液加热到70-80℃，脱色30-50min；将脱色后的酶解液转移至板框过滤池内进行过滤，取澄清液；f、分离纯化：将澄清液转移至泡沫分离柱中进行鼓气起泡，并收集泡沫液，，在鼓气的同时向泡沫分离柱中注水；鼓气速率为3-5L/min，注水速率为0.1-0.3L/min，泡沫分离柱中液体的装载高度与泡沫分离柱内径比为8-10:1，澄清液温度保持在25-35℃；待收集的泡沫液灭泡后，用离子交换器对泡沫液进行重金属分离；向重金属分离后的泡沫液中添加质量为泡沫液1-2%的磁性亲和微球并分散均匀，静置亲和吸附50-70min后利用磁场使磁性亲和微球聚集；分离出磁性亲和微球后，用pH值为7.2的Tris-HCl缓冲液对磁性亲和微球进行洗脱，再次利用磁场分离出磁性亲和微球后，得到洗脱液，将洗脱液在75-85℃下储存备用；g、浓缩：将洗脱液先后输入双效浓缩锅和四效浓缩锅中进行浓缩，制得浓缩液，所述浓缩液的折光度控制在5-6，浓缩后浓缩液在50-60℃下储存；h、膜过滤：将浓缩液通过二级0.22微米膜过滤器进行除杂除菌；其中膜过滤温度小于45℃，一级过滤压力小于0.25MPa，二级过滤压力小于0.4MPa；i、多肽分级：采用超滤膜或纳滤膜对膜过滤后的浓缩液按分子量进行分离，得到目标分子量的水产多肽；j、喷雾干燥：对水产多肽进行喷雾干燥；喷雾温度为80-90℃，喷雾干燥后水产多肽的含水率小于等于5wt%。4.如权利要求3所述的一种无抗水产免疫增强剂的制备方法，其特征在于...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑建华，郑小军，徐章群，周利辉，苏驰晟，
申请(专利权)人：舟山市瑞丰生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江;33