一种肿瘤抗原的制备方法及其制备的肿瘤抗原技术

本发明专利技术涉及细胞免疫技术领域，尤其涉及一种肿瘤抗原的制备方法及其制备的肿瘤抗原。该方法将分离培养的肿瘤细胞与腺病毒共同培养后，弃除沉淀，截留分子量小于30kDa的蛋白。本发明专利技术提供方法制得的肿瘤抗原纯度较高，浓度较大，经检测，其中肿瘤抗原的浓度大于0.5mg/ml。经试验证实，本发明专利技术提供方法制备的肿瘤抗原具有更好的免疫原性，与传统方法制备的抗原相比，其能够使肝癌大鼠的肿瘤体积缩小至原体积的约1/3，使乳腺癌大鼠的肿瘤体积缩小至原体积的1/3，该效果显著优于(p<0.05)现有技术制备的抗原。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及细胞免疫
，尤其涉及一种肿瘤抗原的制备方法及其制备的肿瘤抗原。
技术介绍
细胞生物治疗是运用自身免疫系统的新型癌症治疗方法，具有显著疗效的治疗模式。它运用分子生物学技术和细胞工程学技术，用生物制剂对从病人体内采集的免疫细胞在体外进行培养和扩增，再回输到病人体内，从而激发、增强机体自身的免疫功能，达到监视并杀灭病变细胞或修复受损细胞的目的。对于健康人来说，其免疫系统的强大足以及时清除突变的细胞、修复受损细胞。而当人体的免疫功能低下或紊乱时，就会导致各种疾病甚至诱发肿瘤。癌症病人因为自身免疫系统缺陷或功能衰退，使自身无法识别和清除癌细胞，给癌细胞的蔓延生长以可趁之机，影响人体正常机体功能，甚至导致器官的坏死和衰竭。肿瘤抗原的有效性取决于它的制备方法。肿瘤抗原一般来源于自体或异体肿瘤细胞或其粗提取物，带有肿瘤特异性抗原(tumorspecificantigen，TSA)或肿瘤相关抗原(tumorassociatedantigen，TAA)。虽然有肿瘤抗原多肽库，但肿瘤细胞容易通过抗原变异逃避针对单一抗原表位的免疫作用，因此肿瘤细胞和肿瘤是理想的抗原来源。目前常见的肿瘤抗原的制备方法大致如下：将手术中切除的肿瘤组织剪碎，碾磨，过筛后分离出肿瘤细胞。然后将肿瘤细胞加热灭活，然后经过多次-80℃冷冻和37℃融化，这种反复冻融从而破碎细胞。冻融液离心后，取上清中的蛋白，作为肿瘤抗原。该法制备的肿瘤抗原，蛋白经过变性，特异性抗原容易丢失，其次，无法保证肿瘤细胞的碎片大小，过大的细胞碎片不利于DC细胞的致敏。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术要解决的技术问题在于提供一种肿瘤抗原的制备方法及其制备的肿瘤抗原，本专利技术提供的抗原具有更好的免疫原性。本专利技术提供了腺病毒在制备肿瘤抗原中的应用；腺病毒为重组人p53腺病毒或重组人5型腺病毒。在本专利技术的实施例中，腺病毒为重组人p53腺病毒。腺病毒载体系统可广泛用于人类及非人类蛋白的表达。腺病毒可感染一系列哺乳动物细胞，因此在大多哺乳动物细胞和组织中均可用来表达重组蛋白。腺病毒的复制基因和致病基因均已相当清楚，除了卵细胞以外几乎在所有已知细胞中都不整合到染色体中，因此不会干扰其它的宿主基因，对人类相当安全。以腺病毒制备肿瘤抗原，是将腺病毒转染进肿瘤细胞中，从而促进肿瘤细胞中抗原的表达，并且重组腺病毒的表达物也会存在于抗原中，从而提高所得抗原的免疫原性。本专利技术所述的腺病毒中重组人p53腺病毒由正常人肿瘤抑制基因p53和改构的5型腺病毒基因重组而成。重组人5型腺病毒为删除E1B-55KD和E3区基因片断的重组人5型腺病毒颗粒。本专利技术还提供了一种肿瘤抗原的制备方法，将分离培养的肿瘤细胞与腺病毒共同培养后，弃除沉淀，截留分子量小于30kDa的蛋白，制得肿瘤抗原；腺病毒为重组人p53腺病毒或重组人5型腺病毒。在一些实施例中，腺病毒为重组人p53腺病毒。本专利技术中，肿瘤细胞的获取方式为市场购得或者自行制备，其实施皆在本申请的保护范围内。在一些实施例中，肿瘤细胞的制备方法为：将肿瘤组织破碎后以含15％(体积分数)胎牛血清的DMEM液体培养基培养；所述培养的条件为37℃；5％CO2。本专利技术中，共同培养是指以腺病毒转染肿瘤细胞后，继续培养的步骤。在这一过程中，腺病毒进入肿瘤细胞，并转录和翻译表达特定的抗原，同时刺激肿瘤自身抗原的产生。在一些实施例中，共同培养中，1.0×1011腺病毒滴度与1000万肿瘤细胞共培养。在一些实施例中，共同培养中腺病毒的的病毒量为1.0×1011/ml。在一些实施例中，共同培养的培养基为含15％(体积分数)胎牛血清的DMEM液体培养基。本专利技术中，共同培养的时间为36h～60h。在一些实施例中，共同培养的时间为48h。在一些实施例中，共同培养的的条件为37℃、5％CO2。肿瘤抗原存在于共同培养后的上清液中，对其中分子量小于30kDa的蛋白质进行分离则获得肿瘤抗原。本专利技术中，弃除沉淀的方式为离心，离心的转速为4000rpm，时间为30min。在本专利技术中，截留分子量小于30kDa的蛋白后，还包括透析的步骤。在一些实施例中，透析的透析液为生理盐水。本专利技术中，肿瘤细胞为肝肿瘤细胞或乳腺肿瘤。在一些实施例中，肿瘤细胞为大鼠肝癌细胞；或为大鼠乳腺癌细胞。在一些实施例中，肝癌细胞来自二乙基亚硝胺造模大鼠。在一些实施例中，乳腺癌细胞为MDB-MB-231乳腺癌细胞。本专利技术提供方法能够最大程度地获取肿瘤细胞相关的肿瘤抗原，其他正常组织的蛋白则鲜有混杂，所得肿瘤抗原的纯度较高。经检测，其浓度大于0.5mg/ml。本专利技术还提供了该制备方法制得的肿瘤抗原。本专利技术提供方法制备的肿瘤抗原可用于自体，也可应用于其他同类型肿瘤患者。该抗原可用于DC细胞致敏制备DC抗肿瘤疫苗，也可直接与生理盐水混合制得肿瘤疫苗。经试验证实，本专利技术提供方法制备的肿瘤抗原具有更好的免疫原性，与传统方法制备的抗原相比，其能够使肝癌大鼠的肿瘤体积缩小至原体积的约1/3，使乳腺癌大鼠的肿瘤体积缩小至原体积的1/3，该效果显著优于(p<0.05)现有技术制备的抗原。本专利技术提供的制备方法制得的肿瘤抗原在制备肿瘤疫苗中的应用。本专利技术还提供了一种抗肿瘤疫苗，包括本专利技术提供制备方法制得的肿瘤抗原和生理盐水，肿瘤抗原的浓度为0.5mg/mL。本专利技术提供的抗肝癌疫苗，包括肝癌抗原和生理盐水；其中，肝癌抗原的制备方法为：将分离培养的肝癌细胞与p53腺病毒共同培养后，弃除沉淀，截留分子量小于30kDa的蛋白。本专利技术提供的抗乳腺癌疫苗，包括乳腺癌抗原和生理盐水；其中，乳腺癌抗原的制备方法为：将分离培养的乳腺癌细胞与p53腺病毒共同培养后，弃除沉淀，截留分子量小于30kDa的蛋白。本专利技术还提供了一种DC抗肿瘤疫苗，以本专利技术提供制备方法制得的肿瘤抗原刺激DC细胞制得。本专利技术提供的DC抗肝癌疫苗，以肝癌抗原刺激DC细胞制得；其中，肝癌抗原的制备方法为：将分离培养的肝癌细胞与p53腺病毒共同培养后，弃除沉淀，截留分子量小于30kDa的蛋白。本专利技术提供的DC抗乳腺癌疫苗，以乳腺癌抗原刺激DC细胞制得；其中，乳腺癌抗原的制备方法为：将分离培养的乳腺癌细胞与p53腺病毒共同培养后，弃除沉淀，截留分子量小于30kDa的蛋白。本专利技术提供的肿瘤疫苗或DC抗肿瘤疫苗能够用于治疗癌症，减小肿瘤体积，其给药方式为注射。注射的剂量为每次每只大鼠1ml，相当于肿瘤抗原的给药量为1.43μg/g～1.85μg/g，即每g动物体重给药1.43μg～1.85μg；注射的方法为每3天注射一次，共注射3次。本专利技术提供了腺病毒在制备肿瘤抗原中的应用，其制备方法为将分离培养的肿瘤细胞与腺病毒共同培养后，弃除沉淀，截留分子量小于30kDa的蛋白。本专利技术提供方法制得的肿瘤抗原纯度较高，浓度较大，经检测，其中肿瘤抗原的浓度大于0.5mg/ml。经试验证实，本专利技术提供方法制备的肿瘤抗原具有更好的免疫原性，与传统方法制备的抗原相比，其能够使肝癌大鼠的肿瘤体积缩小至原体积的约1/3，使乳腺癌大鼠的肿瘤体积缩小至原体积的1/3，该效果显著优于(p<0.05)现有技术制备的抗原。具体实施方式本专利技术提供了一种肿瘤抗原的制备方法及其制备的肿瘤抗原，本领域技术人员可本文档来自技高网...

【技术保护点】
腺病毒在制备肿瘤抗原中的应用；所述腺病毒为重组人p53腺病毒或重组人5型腺病毒。

【技术特征摘要】
1.腺病毒在制备肿瘤抗原中的应用；所述腺病毒为重组人p53腺病毒或重组人5型腺病毒。2.一种肿瘤抗原的制备方法，其特征在于，将分离培养的肿瘤细胞与腺病毒共同培养后，弃除沉淀，截留分子量小于30kDa的蛋白，制得肿瘤抗原；所述腺病毒为重组人p53腺病毒或重组人5型腺病毒。3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述腺病毒为重组人p53腺病毒。4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述共同培养中，1.0×1011腺病毒滴度与1000万肿瘤细胞共培养。5.根据权利要求2所述的制备方法，...

【专利技术属性】
技术研发人员：顾宇春，
申请(专利权)人：诺莱生物医学研究院北京有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11