本发明专利技术属于生物制药技术领域，尤其涉及一种具有增强仔猪和肉鸡的机体免疫力、抗菌、杀菌功效的肠溶兽用二联免疫增强剂的制备方法，从猪血中分离白细胞，从分离的白细胞中通过利息破碎粗提抗菌肽，将抗菌肽用凝胶过滤层析纯化；将抗凝血离心得到血浆，通过盐析，纯化，得到免疫球蛋白；将抗菌肽和免疫球蛋白干粉混合制得微胶囊，再将微胶囊通过肠溶包衣液在微胶囊颗粒表面形成肠溶包衣缓释层，制成肠溶微丸，本发明专利技术不仅能够显著提高动物血清中IgG含量，增强仔猪机体免疫力，降低发病率，提高动物的生产性能，而且解决了由于胃肠道中存在着大量肽水解酶和蛋白水解酶降低药物药效和生物利用度的问题，从而使药物吸收效果更好。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物制药
，尤其涉及一种具有增强动物的机体免疫力、抗菌、杀菌功效的肠溶兽用二联免疫增强剂的制备方法。
技术介绍
我国是第一养殖业大国，第一动物保健品消费国，但与发达国家相比，兽用免疫增强剂产业落后，稳定高效、无残留、无污染的新型免疫增强剂的研制及产业化符合绿色食品、绿色生产的发展趋势，对健康畜牧具有重要意义。针对目前我国兽用免疫增强剂的现状，项目组从屠宰场废弃猪血液中性粒细胞中分离提取出小分子抗菌肽，从猪血浆分离纯化免疫球蛋白，利用现代动物生物集成技术，在整体水平、细胞水平及分子水平上，根据不同免疫增强剂作用机制的差异，研究它们之间的协同效应，优化免疫增强剂配方，开发了抗菌肽-免疫球蛋白二联免疫增强剂，发挥两者的协同效应，从直接补充特异性抗体、促进免疫器官发育、激活免疫细胞增强细胞免疫和体液免疫、诱导产生各种细胞因子等多个方面全方位增强动物的机体免疫力提供技术保障。抗菌肽是在诱导的条件下，动物免疫防御系统产生的一类对抗外源性病原体致病作用的防御性肽类活性物质。抗菌肽产品具广谱抗菌作用，杀菌机理独特，病原菌不易对抗菌肽产生耐药性，对畜禽具有促生长、保健和治疗疾病的功能，同时抗菌肽还具有高效的抗真菌和抗病毒、抗肿瘤活性。免疫球蛋白含有大量特异性抗体，可与相应的抗原结合，凝集与沉淀抗原物质，防止病原微生物对机体细胞的侵袭，免疫球蛋白还可与抗原结合后能激活补体，进而产生一系列免疫调节作用，发挥具有免疫效应的细胞对病原微生物的吞噬、溶解和杀灭作用，显著增强机体抗病能力。正是基于这种增强免疫机理的差异以及动物的生理特点，将抗菌肽和免疫球蛋白进行合理搭配，开发出具有稳定、高效、无毒和无残留的肠溶兽用二联免疫增强剂，充分发挥两者的协同效应。此外，现有的兽用二联免疫增强剂大多因药性而带有刺激性，同时制剂往往会因胃液或者酶的作用而失效，药物的有效成分不能在胃肠道中定位释放，不仅降低了药物的生物利用度，而且造成了药物的浪费。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术中的不足而专利技术的一种具有增强动物的机体免疫力、抗菌、杀菌功效的肠溶兽用二联免疫增强剂的制备方法。本专利技术是这样实现的：一种肠溶兽用二联免疫增强剂的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：步骤1）抗菌肽的制备：1.1从猪血中分离白细胞将混合均匀的干净血液放置到无菌容器中，然后在4℃、4000rpm/min的条件下下离心10min，此时无菌容器内的变成悬液，此时悬液分为上、中、下三层，收获中间层，并将中间层放置在另一个无菌容器中，在该容器中加入PBS溶液，然后在4℃、2000rpm/min的条件下离心20min，弃上清，然后再在该容器中加入PBS溶液，然后在4℃、2000rpm/min的条件下离心20min，弃上清，所剩沉淀即为白细胞。1.2抗菌肽的粗提将步骤1.1中的产物放置在超声波细胞粉碎仪中破碎，破碎的条件为功率200W、破碎30s、间歇30s，共三十次，将破碎后的产物在4℃、12000rpm/min的条件下高速冷冻离心30min，收集底层沉淀，该沉淀即为中性颗粒细胞内的颗粒组分；将沉淀中加入适量的乙酸溶液，搅拌溶液至混匀，然后在4℃的条件下放置10～12h，将上述溶液在4℃、12000rpm/min的条件下离心15min，取上清溶液在4℃条件下保存，将沉淀中再次加入适量的乙酸溶液，搅拌溶液至混匀，然后在4℃的条件下放置10～12h，将上述溶液在4℃、12000rpm/min的条件下离心15min，取上清溶液，将两次收集的上清溶液置于55℃～60℃的条件下加热，以去除溶液中的乙酸，直至水分全部蒸发，收集干物质，所得的干物质即为抗菌肽粗提物。1.3抗菌肽的凝胶过滤层析纯化取Superdex30pg凝胶10g与去离子水100ml混匀、溶涨、洗涤后装柱待用；将抗菌肽粗提物溶于醋酸钠溶液中，平衡后将抗菌肽粗提物溶液缓慢流入柱内，尽量避免冲击凝胶，用乙酸钠洗脱，以0.2mol/L乙酸钠溶液为参照，用紫外检测仪检测其OD280处的吸光值，收集各吸收峰，经抗菌活性检测，具有抑菌作用的吸收峰含有目的抗菌肽，将此洗脱液冷冻干燥后保存备用。步骤2）免疫球蛋白的制备：2.1分离血浆将抗凝血在4000rpm/min的条件下离心15min，获得沉降的血细胞和上清液，其中上清液为血浆。2.2盐析取上清液，向上清液中加入PBS缓冲液使得混合后的溶液体积至1L，混匀后加入固体硫酸铵和PBS缓冲液，边加边搅拌使硫酸铵饱和度达到20%，室温静置30min；然后在4℃4000r/min的条件下离心15min，弃沉淀收集上清液。2.3免疫球蛋白的分离向2.2收集的上清液加入固体硫酸铵，使溶液硫酸铵饱和度达到50%，静置30min，然后在4℃5000rpm/min的条件下离心15min，弃上清，所得沉淀即为免疫球蛋白粗品。2.4除盐用PBS缓冲液溶解免疫球蛋白粗品，装入透析袋，在4℃的条件下透析一天，得到脱盐后的免疫球蛋白粗品。2.5DEAE-纤维素纯化免疫球蛋白活化处理DEAE-纤维素后装柱，用吸管将已脱盐的免疫球蛋白粗品沿柱壁缓缓加入柱内，打开流出口，让样品进入柱床；用滴管向柱内沿管壁加入磷酸缓冲液至高出柱面2cm，接通洗脱瓶，调整流速至1.5ml/min，按每管1.5ml连续收集，出现白色沉淀者，即含有纯的免疫球蛋白，继续收集，直至不发生白色沉淀反应时为止，合并蛋白管，并置于-20℃保存。步骤3）配置肠溶兽用二联免疫增强剂将抗菌肽和免疫球蛋白分别低温真空干燥后，制成干粉，将两者按1：2合并，充分混合均匀，并加入辅料甘氨酸、蔗糖和甘露醇，各种辅料按照质量分数的添加量分别为氨酸添加量4%，蔗糖添加量3%，甘露醇添加量3%。进一步优化，在“1.2抗菌肽的粗提”中所用乙酸溶液的密度为9％。进一步优化，在“2.2盐析”中所用PBS缓冲液为1mol/L,PH=7。更进一步优化，步骤3）配置二联免疫增强剂的步骤还包括：将除菌的海藻酸钠溶液充分溶胀至无气泡，按1：3的芯壁材比例包埋步骤3）中所得的二联免疫增强剂，充分溶解并缓慢搅拌10小时，使其均匀；将脱气后的均匀混合液体通过内径约为0.8mm的硅胶管，通过恒流泵以每分钟60滴的速度滴入到2℅体积分数的CaCl2溶液中即成白色球形颗粒，在CaCl2溶液中缓慢持续搅拌2h，成型固化成球状，强球状颗粒转至0.5℅体积分数的壳聚糖溶液中覆膜30分钟，收集后生理盐水洗涤，干燥5—6h，收获微胶囊颗粒，将制得的微胶囊置于流化床包衣机中进行肠溶包衣，通过肠溶包衣液在微胶囊颗粒表面形成肠溶包衣缓释层，制成微丸，流化床进风温度控制在50～60℃，物料温度控制在30～35℃进行包衣，微丸成品水分控制在2%-5%之间，粒度在60～80目之间。更进一步优化，所述的肠溶包衣液是将成膜剂、增塑剂、分散剂、抗黏剂加入到90%的乙醇溶液中，通过均质机20000r/min均质10min配制而成，其中，成膜剂由羟丙甲纤维素邻苯二甲酸酯（5%～10%）或聚丙烯酸树脂II（3%～5%）构成，增塑剂由聚乙二醇（1%～2%）、柠檬酸三乙酯（1%～2%）、单硬脂酸甘油酯（0.5%～2%）中的一种或两种构成，分散剂由聚山梨酯-80（1%～3%）构成，抗黏剂由本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种肠溶兽用二联免疫增强剂的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：步骤1）抗菌肽的制备：1.1从猪血中分离白细胞将混合均匀的干净血液放置到无菌容器中，然后在4℃、4000rpm/min的条件下下离心10min，此时无菌容器内的变成悬液，此时悬液分为上、中、下三层，收获中间层，并将中间层放置在另一个无菌容器中，在该容器中加入PBS溶液，然后在4℃、2000rpm/min的条件下离心20min，弃上清，然后再在该容器中加入PBS溶液，然后在4℃、2000rpm/min的条件下离心20min，弃上清，所剩沉淀即为白细胞；1.2抗菌肽的粗提将步骤1.1中的产物放置在超声波细胞粉碎仪中破碎，破碎的条件为功率200W、破碎30s、间歇30s，共三十次，将破碎后的产物在4℃、12000rpm/min的条件下高速冷冻离心30min，收集底层沉淀，该沉淀即为中性颗粒细胞内的颗粒组分；将沉淀中加入适量的乙酸溶液，搅拌溶液至混匀，然后在4℃的条件下放置10—12h，将上述溶液在4℃、12000rpm/min的条件下离心15min，取上清溶液在4℃条件下保存，将沉淀中再次加入适量的乙酸溶液，搅拌溶液至混匀，然后在4℃的条件下放置10—12h，将上述溶液在4℃、12000rpm/min的条件下离心15min，取上清溶液，将两次收集的上清溶液置于55℃—60℃的条件下加热，以去除溶液中的乙酸，直至水分全部蒸发，收集干物质，所得的干物质即为抗菌肽粗提物；1.3抗菌肽的凝胶过滤层析纯化取Superdex 30 pg凝胶10g与去离子水100ml混匀、溶涨、洗涤后装柱待用；将抗菌肽粗提物溶于醋酸钠溶液中，平衡后将抗菌肽粗提物溶液缓慢流入柱内，尽量避免冲击凝胶，用乙酸钠洗脱，以0.2mol/L乙酸钠溶液为参照，用紫外检测仪检测其OD280处的吸光值，收集各吸收峰，经抗菌活性检测，具有抑菌作用的吸收峰含有目的抗菌肽，将此洗脱液冷冻干燥后保存备用；步骤2）免疫球蛋白的制备：2.1分离血浆将抗凝血在4000 rpm/min的条件下离心15min，获得沉降的血细胞和上清液，其中上清液为血浆；2.2盐析取上清液，向上清液中加入PBS缓冲液使得混合后的溶液体积至1L，混匀后加入固体硫酸铵和PBS缓冲液，边加边搅拌使硫酸铵饱和度达到20﹪，室温静置30min；然后在4℃ 4000 r/min的条件下离心15 min，弃沉淀收集上清液；2.3免疫球蛋白的分离向2.2收集的上清液加入固体硫酸铵，使溶液硫酸铵饱和度达到50%，静置30min，然后在4℃5000 rpm/min的条件下离心15min，弃上清，所得沉淀即为免疫球蛋白粗品；2.4除盐用PBS缓冲液溶解免疫球蛋白粗品，装入透析袋，在4℃的条件下透析一天，得到脱盐后的免疫球蛋白粗品；2.5DEAE‑纤维素纯化免疫球蛋白活化处理DEAE‑纤维素后装柱，用吸管将已脱盐的免疫球蛋白粗品沿柱壁缓缓加入柱内，打开流出口，让样品进入柱床；用滴管向柱内沿管壁加入磷酸缓冲液至高出柱面2cm，接通洗脱瓶，调整流速至1.5ml/min，按每管1.5ml连续收集，出现白色沉淀者，即含有纯的免疫球蛋白，继续收集，直至不发生白色沉淀反应时为止，合并蛋白管，并置于‑20℃保存；步骤3）配置肠溶兽用二联免疫增强剂将抗菌肽和免疫球蛋白分别低温真空干燥后，制成干粉，将两者按1：2合并，充分混合均匀，并加入辅料甘氨酸、蔗糖和甘露醇，各种辅料按照质量分数的添加量分别为氨酸添加量4%，蔗糖添加量3%，甘露醇添加量3%。...
【技术特征摘要】
1.一种肠溶兽用二联免疫增强剂的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：步骤1）抗菌肽的制备：1.1从猪血中分离白细胞将混合均匀的干净血液放置到无菌容器中，然后在4℃、4000rpm/min的条件下下离心10min，此时无菌容器内的变成悬液，此时悬液分为上、中、下三层，收获中间层，并将中间层放置在另一个无菌容器中，在该容器中加入PBS溶液，然后在4℃、2000rpm/min的条件下离心20min，弃上清，然后再在该容器中加入PBS溶液，然后在4℃、2000rpm/min的条件下离心20min，弃上清，所剩沉淀即为白细胞；1.2抗菌肽的粗提将步骤1.1中的产物放置在超声波细胞粉碎仪中破碎，破碎的条件为功率200W、破碎30s、间歇30s，共三十次，将破碎后的产物在4℃、12000rpm/min的条件下高速冷冻离心30min，收集底层沉淀，该沉淀即为中性颗粒细胞内的颗粒组分；将沉淀中加入适量的乙酸溶液，搅拌溶液至混匀，然后在4℃的条件下放置10—12h，将上述溶液在4℃、12000rpm/min的条件下离心15min，取上清溶液在4℃条件下保存，将沉淀中再次加入适量的乙酸溶液，搅拌溶液至混匀，然后在4℃的条件下放置10—12h，将上述溶液在4℃、12000rpm/min的条件下离心15min，取上清溶液，将两次收集的上清溶液置于55℃—60℃的条件下加热，以去除溶液中的乙酸，直至水分全部蒸发，收集干物质，所得的干物质即为抗菌肽粗提物；1.3抗菌肽的凝胶过滤层析纯化取Superdex30pg凝胶10g与去离子水100ml混匀、溶涨、洗涤后装柱待用；将抗菌肽粗提物溶于醋酸钠溶液中，平衡后将抗菌肽粗提物溶液缓慢流入柱内，尽量避免冲击凝胶，用乙酸钠洗脱，以0.2mol/L乙酸钠溶液为参照，用紫外检测仪检测其OD280处的吸光值，收集各吸收峰，经抗菌活性检测，具有抑菌作用的吸收峰含有目的抗菌肽，将此洗脱液冷冻干燥后保存备用；步骤2）免疫球蛋白的制备：2.1分离血浆将抗凝血在4000rpm/min的条件下离心15min，获得沉降的血细胞和上清液，其中上清液为血浆；2.2盐析取上清液，向上清液中加入PBS缓冲液使得混合后的溶液体积至1L，混匀后加入固体硫酸铵和PBS缓冲液，边加边搅拌使硫酸铵饱和度达到20﹪，室温静置30min；然后在4℃4000r/min的条件下离心15min，弃沉淀收集上清液；2.3免疫球蛋白的分离向2.2收集的上清液加入固体硫酸铵，使溶液硫酸铵饱和度达到50%，静置30min，然后在4℃5000rpm/min的条件下离心15min，弃上清，所得沉淀即为免疫球蛋白粗品；...
【专利技术属性】
技术研发人员：王永芬，马辉，张震，郭宏伟，郑鸣，赵绪永，
申请(专利权)人：河南牧业经济学院，
类型：发明
国别省市：河南;41
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