一种苦瓜蛋白肠溶片的制备工艺制造技术

一种苦瓜蛋白肠溶片的制备工艺，将种子去壳，然后放入研钵中加入液氮进行研磨；接着使用CTAB法得到全基因组；根据苦瓜蛋白MAP30的基因序列设计相关引物，确定PCR的条件及体系；PCR产物回收后进行TA克隆，导入感受态细胞DH5α，筛选出阳性菌落，培养后进行双酶切；过夜培养PET‑28a，提取表达质粒，进行酶切；将经双酶切过后的目标DNA片段和表达质粒片段在solution Ⅰ体系下进行过夜连接；接着将其导入BL21(DE)感受态细胞中，筛选出阳性菌落；将阳性菌落放大培养并在IPTG的诱导下进行蛋白的表达；将蛋白进行纯化干燥；得到目标蛋白MAP30将作为主要的有效成分与一系列辅料共同制成有保健功能的苦瓜蛋白肠溶片；本发明专利技术的苦瓜片中有效蛋白MAP30的含量高，更能促进人体的健康。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及基因工程
，具体涉及一种苦瓜蛋白肠溶片的制备工艺。
技术介绍
传统的植物药研究思路一般为繁琐的提取分离，最终需要从提取的复合成分中分离出具有活性的单一成分。然而植物药的相关有效成分往往含量较低，分离步骤繁琐，采用传统的提取方法效率很低，会无法满足后期的研究生产需要。当今分子生物技术已日趋成熟，利用基因工程实现某一目的产物的异源生产已经成为了新的研究热点。近年来，随着提取分离技术的发展，人们从苦瓜中分离到多种具有降血糖、抗突变、抗肿瘤以及提高人体免疫力等功效的核糖体失活蛋白，其中在这些苦瓜蛋白成分中，分子量为30kD的I型核糖体失活蛋白MAP30(Momordicaanti-HIVproteinof30kD)的各项性能优越，具有免疫调节、抗病毒、抗肿瘤、抗真菌作用，对人体健康十分有益，可制成一种保健药品。但作为一种蛋白，制成普通的制剂会在胃中被消化破坏，而通过从苦瓜中利用传统方法提取MAP30污染大，效率低，故准备先利用基因工程技术通过工本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种苦瓜蛋白肠溶片的制备工艺，其特征在于：包括以下步骤：步骤一：苦瓜原料的处理：取适量的成熟苦瓜中的种子，除去种子壳，然后放入研钵中，加入适量的液氮研磨成粉末状，分装得到处理后苦瓜种子粉；步骤二：苦瓜种子粉的处理：将步骤一中分装后的苦瓜种子粉，利用CTAB法提取得到苦瓜全基因组，作为PCR反应的模板；步骤三：PCR反应的确定：首先根据相关苦瓜蛋白MAP30的基因序列设计相关的引物，并最终确定PCR的条件及体系；步骤四：TA克隆：PCR产物回收后进行TA克隆，并导入感受态细胞DH5α，经蓝白斑筛选、菌落PCR，筛选出阳性菌落，提取目标DNA片段后进行双酶切；步骤五：表达载体的处理：过夜培养PET...

【技术特征摘要】
1.一种苦瓜蛋白肠溶片的制备工艺，其特征在于：包括以下步骤：
步骤一：苦瓜原料的处理：取适量的成熟苦瓜中的种子，除去种子壳，然后放入研钵中，加入适量的液氮研磨成粉末状，分装得到处理后苦瓜种子粉；
步骤二：苦瓜种子粉的处理：将步骤一中分装后的苦瓜种子粉，利用CTAB法提取得到苦瓜全基因组，作为PCR反应的模板；
步骤三：PCR反应的确定：首先根据相关苦瓜蛋白MAP30的基因序列设计相关的引物，并最终确定PCR的条件及体系；
步骤四：TA克隆：PCR产物回收后进行TA克隆，并导入感受态细胞DH5α，经蓝白斑筛选、菌落PCR，筛选出阳性菌落，提取目标DNA片段后进行双酶切；
步骤五：表达载体的处理：过夜培养PET-28a，提取表达质粒，并用与步骤四相同的两种酶进行酶切；
步骤六：连接：用步骤四与步骤五中相同酶切的片段在solutionⅠ的体系中进行过夜连接；
步骤七：将步骤六中的过夜连接的产物导入感受态细胞BL21(DE)，经蓝白斑筛选、菌落PCR，筛选出阳性菌落；
步骤八：将步骤七中筛选出的阳性菌落放大培养并在IPTG的诱导下进行苦瓜蛋白MAP30的表达；
步骤九：发酵培养后，经一系列处理将步骤八得到的的苦瓜蛋白MAP30进行纯化干燥；
步骤十：制肠溶片：首先将步骤九中确定发酵得到的苦瓜蛋白MAP30与辅料的比例，最后经粉碎、过筛、配料、混合、湿法制粒、颗粒干燥、压片、包肠溶衣、包装后储存。
2.根据权利要求1所述的一种苦瓜蛋白肠溶片的制备工艺，其特征在于，所述步骤一中苦瓜粉分装为：每管中分装的具体量为10-15g。
3.根据权利要求1所述的一种苦瓜蛋白肠溶片的制备工艺，其特征在于，所述步骤二中CTAB法的具体过程为：将水浴锅温控钮调至60℃，预热CTAB提取缓冲液→研磨得到的苦瓜粉末转移至10mL预热CTAB提取缓冲液中，60℃下不时晃动离心管，保温1h→冷却片刻，加入10mL氯仿/异戊醇(24:1)，剧烈震荡离心管，10000r/min离心15min→上清液转入装有25mL100％乙醇的新离心管，轻柔地颠倒混匀→10000r/min离心15min，弃上清，得到DNA沉淀→加700μl70％乙醇，70μl3mol/LNaAc溶液以漂洗DNA沉淀，然后转至1.5mLEppendorf→10000r/min离心30s→再用70％乙醇漂洗DNA沉淀，离心30s，弃上清液→室温下挥发乙醇→加入500μlTE，4℃过夜溶解DNA→加4-10μlRNaseA，颠倒混匀，并在55℃下保温30-60min→加入1.25mL乙醇、54μlNaAc，沉淀DNA→离心30s，室温下挥发乙醇→DNA沉淀溶解在300μlTE中。
4.根据权利要求1所述的一种苦瓜蛋白肠溶片的制备工艺，其特征在于，所述步骤三中引物设计为F15′-CGTCGACCTGTGGTATGCTTACTACTT-3′F25′-GGAATTCTCAATTCACAACAGATTCC-3′，引入的酶切位点为SalⅠ和EcoRⅠ；
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【专利技术属性】
技术研发人员：龚国利，蔡东梅，李慧，
申请(专利权)人：陕西科技大学，
类型：发明
国别省市：陕西;61