本发明专利技术涉及一种抗14型肺炎球菌荚膜多糖的中和性单克隆抗体及其产生该抗体的杂交瘤细胞株，该杂交瘤细胞株的保藏编号为CGMCC No.9455。本发明专利技术的单克隆抗体效价高、特异性好，能在体外有效中和14型肺炎球菌的感染，可以有效的清除细菌，在肺炎诊断和治疗方面具有较大的应用前景；该单克隆抗体可以应用于肺炎疫苗的多糖含量检测，还可以用于酶联免疫法检测多糖含量，突破了目前的检测方法。
【技术实现步骤摘要】
14型肺炎球菌中和性单克隆抗体及其应用
本专利技术涉及免疫学与疫苗学领域，具体涉及一种抗14型肺炎球菌荚膜多糖的中 和性单克隆抗体及其产生该抗体的杂交瘤细胞株以及抗体的应用。
技术介绍
肺炎球菌又叫做肺炎链球菌或者肺炎双球菌，共有91种血清型，是一种常见 的革兰氏阳性双球致病菌。1881年法国的巴斯德及美国的G. M. Sternberg分别首次在 法国及美国从患者痰液中分离这种革兰氏阳性的双球菌-肺炎球菌（Streptococcus pneumoniae)，并把它命名为巴斯德微球菌。1886年Weichselbaum发现肺炎球菌是人大叶 性肺炎的主要致病菌，能够引起肺炎等疾病。磺胺药和抗生素问世前，肺炎球菌的发病率和 死亡率都极高。上世纪30-40年代，上述药物相继问世，它们对肺炎球菌感染有明显的疗 效，成为控制疾病的有效药物。随着抗生素的长期大量使用，自1963年Hansman首次报道了 肺炎球菌对四环素的耐药性起，很多国家都出现了对抗生素的耐药株，并且各国耐药株所 耐抗生素不完全一致。肺炎球菌已经成为各国各年龄组人群社区获得性肺炎最常见病因， 也是引起中耳炎、肺炎、脑膜炎和败血症等疾病的主要致病菌。由于抗生素抗性问题，该病 菌严重影响着人类健康，疫苗日益成为预防它的主要手段。 1911年才开始使用全菌体疫苗来预防肺炎球菌感染。1914年南非金矿矿工由于 不断发生大叶性肺炎，采用加热死菌菌体免疫来控制这种流行病。1915年报道用5价疫苗 免疫人体，但接种局部不良反应强，免疫效果差，有关预防接种的有效性和实用性的争论一 直延续到了 1939年磺胺药问世。1937年有一篇关于用1型肺炎球菌全菌体疫苗给婴儿 免疫的报告证明了人的生命早期对多糖抗原的应答性达不到最佳程度，因而全菌体疫苗逐 渐被淘汰。到1978年，14价肺炎球菌荚膜多糖疫苗在美国正式上市。1983年23价肺炎球 菌多糖疫苗研制成功并投放市场并销售至今。目前国际上主要有默克（Pneum 〇vaX23)、辉 瑞（Pnu-imune23)、赛诺菲巴斯德（Pneum〇23)的几个品牌。中国上市的肺炎球菌多糖疫苗 包括默克（纽莫法23)、赛诺菲巴斯德（优博23)、成都生物制品研究所（惠益康）3种产 品。我国于2006年研制出23价肺炎球菌多糖疫苗并上市销售。23价肺炎球菌多糖疫苗包 括血清型 1、2、3、4、5、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F 和33F。多糖疫苗中的各型多糖的含量是有效保证疫苗免疫原性的基础。因此对各型多糖 含量准确定量成为疫苗控制的重点。 目前国际上通用的肺炎球菌疫苗各型多糖含量的检测方式是速率免疫浊度法，该 方法基于抗原抗体反应。目前广泛应用的抗体是来源于丹麦血清研究所（SSI)的肺炎球菌 鉴别用肺炎血清，该血清为兔多抗血清，采购的成本高、采购周期比较长，不同批次之间存 在一定的差异，抗体水平低、用量大，这都制约着国内企业的肺炎疫苗的研究与开发。单克 隆抗体具有特异性好、效价高等特性，同时，有关于单克隆抗体用于免疫浊度试验的报道。 因此，制备效价高、特异性好的肺炎多糖型特异性的单克隆抗体，可以克服上述问题。
技术实现思路
本专利技术的目的是突破目前的兔多抗检测原料存在的抗体效价低、不同批次间差异 较大、来源单一、采购周期长、费用高的缺陷；本专利技术的目的是提供一种新的具有中和14型 肺炎球菌荚膜多糖的、一致性好、效价高、均一度高、具有良好特异性的低成本的单克隆抗 体，实现降低成本、提高质控的一致性和减少采购周期与试验成本的目标。 为了达到上述目的，本专利技术提供一种14型肺炎球菌单克隆抗体细胞株，其保藏 编号为 CGMCC No. 9455。 所述14型肺炎球菌单克隆抗体细胞株已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会 普通微生物中心（China General Microbiological Culture Collection Center，CGMCC)， 地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101，保藏编 号CGMCC No. 9455,分类命名为：14型肺炎球菌单克隆抗体细胞株，保藏日期2014年7月8 曰。 本专利技术还提供了由上述杂交瘤细胞株分泌产生的单克隆抗体。 具体而言，本专利技术采用小鼠骨髓瘤细胞杂交瘤技术制备14型肺炎球菌单克隆抗 体，步骤如下： (1)制备14型肺炎球菌发酵液。 (2)动物免疫：收集菌体，研磨，然后将研磨后的14型肺炎球菌菌体与佐剂混合并 乳化；乳化后免疫小鼠。 (3)加强免疫；首次免疫后，对小鼠进行2次加强免疫。免疫后间接采用酶联免疫 法检测抗体效价，如果抗体效价大于1〇 3,则进行研磨抗原的腹腔冲击。 (4)取免疫后的小鼠脾脏，将脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0按1:2?10:1的比 例混合，于37°C水浴滴加50% PEG4000进行细胞融合；然后缓慢加入无血清培养基洗涤融 合后的细胞，再加入完全培养基重悬，将细胞悬液l〇〇ul/孔加入到细胞培养板培养，培养 后添加 HAT培养液。 (5)杂交瘤长到瓶底的60%以上时，ELISA法检测细胞上清中的抗体效价。筛选 出高效价的单抗细胞株，扩大培养建库，冻存。 (6)将冻存的工作种子库细胞复苏，培养到细胞覆盖瓶底的60 %以上时摇下细 胞，计数，腹腔免疫小鼠，制备腹水。 本专利技术还提供包含上述单克隆抗体的试剂盒。 所述试剂盒中，所述单克隆抗体经生物标记或化学标记。 进一步地，所述单克隆抗体经酶标记。 进一步地，所述单克隆抗体经辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶标记。 所述试剂盒用于肺炎球菌14型多糖的检测。 本专利技术还提供所述单克隆抗体在检测肺炎多糖疫苗中14型多糖含量中的应用。 所述应用中，所述单克隆抗体经生物标记或化学标记。 进一步地，所述单克隆抗体经酶标记。 进一步地，所述单克隆抗体经辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶标记。 本专利技术的关键点在于： 1、将14型肺炎球菌经研磨与佐剂处理后免疫小鼠，优于研磨菌体直接免疫，前者 可以产生较高水平的免疫原性，满足融合需求。 2、杂交瘤细胞筛选时，采用14型多糖以及CPS多糖，确保筛选得到的杂交瘤细胞 为抗14型多糖的特异性杂交瘤细胞株。 3、制备的14型肺炎球菌荚膜多糖单克隆抗体腹水，具有较高的效价，较好的特异 性；试验表明，该单抗可以用于23价肺炎球菌多糖疫苗和7价肺炎球菌结合疫苗的速率免 疫浊度法14型肺炎球菌荚膜多糖含量的检测；该单抗进行酶标记之后可制备酶标二抗， 用作双抗体夹心的第二抗体还可用于制备14型肺炎球菌荚膜多糖含量或者抗体效价的 ELISA检测试剂盒；该单抗作为包被物可用于制备14型肺炎球菌荚膜多糖含量或者抗体效 价的ELISA检测试剂盒；该单抗作为反应时的阻断原料可用于制备14型肺炎球菌荚膜多糖 含量或者抗体效价的ELISA检测试剂盒。 本专利技术相对于现有技术具有以下优点和效果： (1)本专利技术表明，肺炎球菌菌体可以制备出和14型肺炎球菌荚膜多糖反应的本文档来自技高网...
【技术保护点】
14型肺炎球菌中和性单克隆抗体杂交瘤细胞株，其保藏编号为CGMCC No.9455。
【技术特征摘要】
1. 14型肺炎球菌中和性单克隆抗体杂交瘤细胞株，其保藏编号为CGMCC No. 9455。2. 由权利要求1所述杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体。3. 包括权利要求2所述的单克隆抗体的试剂盒。4. 根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述单克隆抗体经生物标记或化学标 记。5. 根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述单克隆抗体经酶标记。6. 根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于...
【专利技术属性】
技术研发人员：蔡芳，王欣，陈磊，童钦，高强，尹卫东，
申请(专利权)人：北京科兴中维生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11
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