当前位置: 首页 > 专利查询>中山大学专利>正文

抗CD3单域抗体制造技术

技术编号:14050689 阅读:110 留言:0更新日期:2016-11-24 23:54
本发明专利技术提供一种抗CD3单域抗体,其氨基酸序列选自SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 3。本发明专利技术进一步提供编码该抗CD3单域抗体的核苷酸序列、包含该核苷酸序列的表达载体及宿主细胞。本发明专利技术提供的抗CD3单域抗体拮抗人CD3ε N‑末端部分,这些抗体可以用于比如CD3的测定,以及其他需要CD3的功能蛋白,例如双特异性抗体。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及抗CD3单域抗体(sdAb)及其氨基酸、核苷酸编码序列。本专利技术还涉及包含该核苷酸编码序列的表达载体和宿主细胞。
技术介绍
自1975年单克隆抗体技术问世之后,抗原特异性的抗体已改变了生物学和医学的多个方面。除了作为重要性的研究工具,单克隆抗体的可用性为发展人类疾病的诊断和新疗法开辟了道路。然而,单克隆抗体在应用范围上有技术上的限制和缺点,例如基于哺乳动物表达系统较昂贵。在过去的几十年,一系列的新技术和方法用于改善传统抗体的性能,尤其是在肿瘤治疗中。例如,给现有抗体加有毒的化合物,包括放射性同位素被链接到单克隆抗体。然而,甚至直到今天,临床使用单克隆抗体量仍然很少。另一个提高肿瘤杀灭效率的方法是使用双特异性的抗体,将免疫细胞引到肿瘤细胞,从而杀死肿瘤细胞。而最常用的是使用抗CD3抗体将T细胞引到肿瘤细胞。它是通过同时绑定CD3和肿瘤细胞的表面抗原(TAA),这种双特异性抗体可以能够触发T细胞介导的肿瘤细胞溶解。CD3(群集分化 3)T细胞受体有助于激活细胞毒性T细胞。它是由四个不同的链组成的一种复杂的蛋白质。在哺乳动物中,包含CD3γ链、CD3δ链和两个CD3ε链。很多双特异性抗体使用单链抗体。单链抗体是从传统的IgG分子得到的完整的最小的抗原结合片段。不幸的是,细菌表达的scFvs产量很低。骆驼和羊驼包含一种独特类型的抗体,这类抗体缺乏轻链。因为比常规抗体缺失CH1,这些所谓的重链抗体有较低的分子量。这类免疫球蛋白可变的重链简称VHH,以区别于经典的重链可变区。因此,单个域VHH 是最小可用完整抗原结合15 kDa 片段,被称为纳米抗体。纳米抗体与Fab、Fv或单链抗体相比,有一些独特的优势,如更稳定、更易于在细菌表达。现有技术中抗CD3抗体形式单一并且不能满足实际需求,因此有必要开发出更多的抗CD3抗体,从而为生产和设计功能蛋白提供更多的选择。
技术实现思路
本专利技术一方面涉及一种抗CD3单域抗体,其氨基酸序列选自SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 3。本专利技术另一方面涉及一种编码本专利技术的抗CD3单域抗体的核苷酸序列。在一个实施方式中,该核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示。在另一个实施方式中,该核苷酸序列如SEQ ID NO. 4所示。本专利技术再一个方面涉及一种表达载体,其包含本专利技术的核苷酸序列。本专利技术还涉及包含该表达载体的宿主细胞。在一个实施方式中,该宿主细胞是大肠杆菌。本专利技术还涉及一种双特异性抗体,其包含本专利技术所述的任一CD3单域抗体。本专利技术提供的抗CD3单域抗体拮抗人CD3ε N-末端部分,这些抗体可以用于比如CD3的测定,以及其他需要CD3的功能蛋白,例如双特异性抗体。附图说明图1是sdAb噬菌体展示库的骨架图。图2显示了血清效价实验结果。图3.淋巴细胞分离的总RNA的琼脂糖凝胶电泳图。M泳道,DNA标记物Marker III;第1-3泳道,分离自第一次抽血的淋巴细胞的总RNA;第4-7泳道,分离自第二次抽血的淋巴细胞的总RNA;第8-10泳道,分离自第三次抽血的淋巴细胞的总RNA。图4.纯化的VHH PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图。M泳道,DNA标记物Marker III;第1-8泳道,使用8对引物从第一次抽血的PBMC得到的纯化的VHH PCR产物;第9-16泳道,使用8对引物从第二次抽血的PBMC得到的纯化的VHH PCR产物;第17-24泳道,使用8对引物从第三次抽血的PBMC得到的纯化的VHH PCR产物。图5. sdAb噬菌体展示库的插入率。使用M13R (-48)和M13F (-47)引物通过PCR扩增96个随机选取的文库克隆。具有~1100 bp DNA条带的克隆具有VHH插入物。具体实施方式本专利技术现将结合以下实验及附图进一步阐释,需要说明的是,这些实验例及附图不应解释为对本专利技术的限制。1 策略本专利技术通过噬菌体展示技术开发出了抗CD3的单域抗体,并且进行了以下步骤:动物免疫和免疫响应测试、sdAb噬菌体展示库的构建、噬菌体展示淘选以及FASEBA筛选和FACS验证。2 材料抗原蛋白: CD3-His蛋白(MP-5)抗原细胞系: Jurkat靶标细胞, KPCN对照细胞TRIzol® Reagent (Ambion, Cat. No. : 15596-026)PrimeScriptTM 1st Strand cDNA合成试剂盒(Takara, Cat. No. : 6110A)Sfi I酶(NEB, Cat. No. : R0123S)宿主菌: E.coli SS320氨苄青霉素, 100 mg/ml异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG), 1 MPBS: 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 4.3 mM Na2HPO4, 1.4 mM KH2PO4, pH 7.4ELISA微滴定板 (Corning, Cat. No. : 9018)包被缓冲液: 0.05 M NaHCO3, pH 9.6封闭缓冲液 (PBST): PBS缓冲液, pH 7.4,加入5%脱脂奶粉洗涤缓冲液: PBS缓冲液, pH 7.4, ,加入0.05% Tween 20M13KO7辅助噬菌体(NEB, Cat. No. : N0315S)HRP/抗M13单克隆抗体 (GE Healthcare, Cat. No. : 27-9421-01)羊抗驼IgG[HRP] (Novus Biological, Cat. No. : NB7242)兔抗驼IgG[HRP] (GenScript)FACSCalibur (BD Bioscience, San Jose, CA)Flowjo: Flowjo 7.6.1 Min software2×YT: 16 g胰蛋白胨, 10 g酵母提取物, 5 g NaCl溶解于1 L ddH2O.OctetRED96 (ForteBio)Super Streptavidin (SSA) Dip and ReadTM Biosensors (ForteBio)10 mM 甘氨酸-HCl, pH 2.03方法3.1动物免疫和免疫响应测试3.1.1 动物免疫将CD3-His免疫原与佐剂或PBS混合并注射到美洲驼(llama)。在整个项目过程中,动物被免疫五次。分别在免疫之前以及第4次和第5次免疫之后采集外周血样品。梯度分离法分离出淋巴细胞。细胞中加入RNAlater并储存于-80°C。离心加入了抗凝剂的血液得到血清,并储存于-80°C。3.1.2 免疫响应测试使用血清样品通过ELISA评价针对固定的免疫原的免疫响应。评价了免疫前以及第4次和第5次免疫后的血清。抗原(CD3-His和CD34-Fc)分别稀释于4 μg/ml的包被缓冲液中。使用稀释的抗原对微滴定板包被过夜,4°C。随后,以洗涤缓冲液洗涤微滴定板3次,再于37°C用封闭缓冲液封闭2小时。再用洗涤缓冲液洗涤微滴定板4次。将一系列稀释的血清加入板上,在37°C孵育2小时。随后用洗涤缓冲液洗涤微滴定板4次。加入羊抗驼IgG [HRP]或兔抗驼IgG [HRP],在37°C孵育1小时。洗涤后,反应物中加入TMB底物反应10分钟,随后加入1 M HCl终止反应。MK3分光计测定每孔在本文档来自技高网
...
抗CD3单域抗体

【技术保护点】
一种抗CD3单域抗体,其氨基酸序列选自SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 3。

【技术特征摘要】
1.一种抗CD3单域抗体,其氨基酸序列选自SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 3。2.一种编码权利要求1所述的抗CD3单域抗体的核苷酸序列。3.根据权利要求2所述的核苷酸序列,其中所述核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示。4.根据权利要求2所述的核苷酸序列,其中所述核...

【专利技术属性】
技术研发人员:李庆王忠
申请(专利权)人:中山大学
类型:发明
国别省市:广东;44

网友询问留言 已有0条评论
  • 还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。

1