一种人源抗VEGFR2抗体及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种人源抗VEGFR2抗体及其应用。本发明专利技术提供的人源抗VEGFR2抗体，为一种IgG，其重链由重链可变区和重链恒定区组成，其轻链由轻链可变区和轻链恒定区组成；所述重链可变区中的CDR1、CDR2和CDR3依次为序列表的序列1自N末端第45-54位氨基酸残基、第69-85位氨基酸残基和第118-124位氨基酸残基；所述轻链可变区中的CDR1、CDR2和CDR3依次为序列表的序列3自N末端第44-54位氨基酸残基、第70-76位氨基酸残基和第109-117位氨基酸残基。本发明专利技术对于人脐静脉内皮细胞的增殖和迁移引起的疾病以及肿瘤的治疗具有重大的应用价值。

【技术实现步骤摘要】
一种人源抗VEGFR2抗体及其应用
本专利技术涉及一种人源抗VEGFR2抗体及其应用。
技术介绍
肿瘤血管为肿瘤发生、发展提供足够的氧分和营养，靶向肿瘤血管新生可以达到饿死肿瘤的治疗效果，但是肿瘤血管新生的分子调控机制非常复杂，需要许多生长因子、受体及信号通路的介导。血管内皮细胞生长因子(VEGF)是血管新生的必要细胞因子，而VEGFR2是VEGF的三个受体之一，主要负责血管新生的信号通路转导。针对VEGF的抑制剂贝伐单抗(Bevacizumab)是由基因泰克公司开发的一种针对VEGF的重组人源化单克隆抗体，由93％人源和7％的鼠源部分组成。2004年2月26日获得FDA的批准在美国上市是美国第一个获得批准上市的抑制肿瘤血管生成的药物。贝伐单抗2004年全球销售额为5.56亿美元，2013达到为70.37亿美元。针对VEGFR2的抑制剂雷莫卢单抗(ramucirumab)，是礼来公司收购ImClone公司的IMC-1121B项目后，开发并成功上市。雷莫卢单抗是针对VEGFR2的全人IgG1单克隆抗体，特异性结合KDR/VEGFR2。该药物于2014年5月在美国上市，应用于晚期或转移性胃癌或胃食管结合部腺癌。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种人源抗VEGFR2抗体及其应用。本专利技术提供的人源抗VEGFR2抗体，为一种IgG，其重链由重链可变区和重链恒定区组成，其轻链由轻链可变区和轻链恒定区组成；所述重链可变区中的CDR1、CDR2和CDR3依次为序列表的序列1自N末端第45-54位氨基酸残基、第69-85位氨基酸残基和第118-124位氨基酸残基；所述轻链可变区中的CDR1、CDR2和CDR3依次为序列表的序列3自N末端第44-54位氨基酸残基、第70-76位氨基酸残基和第109-117位氨基酸残基。所述重链具体可为序列表的序列1所示的多肽。所述轻链具体可为序列表的序列3所示的多肽。编码所述IgG的基因也属于本专利技术的保护范围。编码所述重链的基因为如下(1)或(2)：(1)序列表的序列2自5’末端第10-1398位核苷酸所示的DNA分子；(2)序列表的序列2所示的DNA分子；编码所述轻链的基因为如下(3)或(4)：(3)序列表的序列4自5’末端第25-726位核苷酸所示的DNA分子；(4)序列表的序列4所示的DNA分子。本专利技术还保护所述IgG在制备抑制血管细胞生长和/或增殖和/或迁移和/或微管形成的产品中的应用。所述血管细胞为人脐静脉内皮细胞。所述人脐静脉内皮细胞具体为HUVEC细胞。本专利技术还保护所述IgG在制备抑制脉络膜新生血管形成的产品中的应用。本专利技术还保护所述IgG在制备抑制肿瘤细胞生长和/或增殖的产品中的应用。所述肿瘤细胞为人肝癌细胞。所述人肝癌细胞具体为HepG-2细胞。本专利技术还保护所述IgG在制备抑制肿瘤生长的产品中的应用。所述肿瘤生长体现为肿瘤的体积变大和/或肿瘤的质量增加。所述肿瘤具体可为肝癌。所述肿瘤具体可为人肝癌细胞引起的肿瘤或皮下移植瘤。所述人肝癌细胞具体为HepG-2细胞。本专利技术提供了对VEGFR2的全人单克隆抗体，能够阻断VEGFR2与其配体VEGF结合，抑制人脐静脉内皮细胞的增殖和迁移。本专利技术对于人脐静脉内皮细胞的增殖和迁移引起的疾病以及肿瘤的治疗具有重大的应用价值。附图说明图1为重组质粒pCMV-H+L的结构示意图。图2为FORTBIO试验结果。图3为抗体能有效抑制VEGF诱导的HUVEC细胞增殖的试验结果。图4为抗体能有效抑制HUVEC细胞增殖的试验结果。图5为抗体有效抑制HUVEC细胞迁移的试验结果。图6为抗体有效抑制HUVEC细胞微管形成的试验结果。图7为分组处理过程中受试动物的体重变化。图8为分组处理结束后，受试动物的瘤重分布图(每个点单表一个受试动物)。图9为分组处理结束后，受试动物的肿瘤体积。图10为分组处理结束后，受试动物的瘤体积抑制率。图11为荧光面积改善率结果。图12为眼底视网膜增厚改善率结果。具体实施方式以下的实施例便于更好地理解本专利技术，但并不限定本专利技术。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。CHO细胞(中国仓鼠卵巢细胞)：ATCC编号为CRL-9096。HUVEC细胞(人脐静脉内皮细胞)：sciencell公司，产品目录号为8000。HepG-2细胞(人肝癌细胞株)：ATCC编号为A019。实施例1、VEGFR2特异抗体的发现一、人源单克隆抗体文库建立从30名知情同意的志愿者获得外周血，分离淋巴细胞并提取总RNA。将总RNA反转录得到cDNA。以cDNA为模板，用兼并引物PCR扩增抗体重链和轻链的可变区(VH和VL)。PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，回收VH的DNA和VL的DNA，用重叠PCR连接成单链抗体(scFv)基因。将来自不同的志愿者的单链抗体基因等量混合，分组用内切酶切割，然后进行1％琼脂糖凝胶电泳，回收DNA片段并连接到已经用相同内切酶切割的噬菌粒载体质粒，将连接后的噬菌粒载体质粒用电钻孔转染大肠杆菌，获得噬菌体单链抗体库。二、VEGFR2人源单克隆抗体筛选首先将重组人VEGFR2蛋白质包被在10厘米板上，加入单链抗体噬菌体并孵育，洗去未结合的噬菌体，回收结合的噬菌体并感染大肠杆菌，以便扩增噬菌体。将第一轮获得并扩增的噬菌体再加入到包被有VEGFR2蛋白质的10厘米板，进行第二轮筛选，如此重复，共进行三轮筛选富集。通过ELISA检测富集的噬菌体对VEGFR2蛋白质的亲和力。在三轮筛选的基础上，通过PCR扩增阳性噬菌体内的抗体序列，获得若干抗VEGFR2蛋白质的单链抗体。将各个单链抗体的VH的DNA和VL的DNA分别克隆到人IgG1重链和轻链的恒定区氨基端，然后连接到哺乳动物表达载体，转染CHO细胞，获得若干抗VEGFR2全长抗体。通过ELISA比较各抗体对VEGFR2蛋白质的结合能力，其中一个抗体表现出对VEGFR2蛋白质的高度亲和力，将该抗体命名为VEGFR2特异抗体。VEGFR2特异抗体的重链如序列表的序列1所示，重链可变区含有三个CDR区域(CDR1、CDR2和CDR3依次为序列表的序列1自N末端第45-54位氨基酸残基、第69-85位氨基酸残基和第118-124位氨基酸残基)。VEGFR2特异抗体的重链的编码序列如序列表的序列2所示。VEGFR2特异抗体的轻链如序列表的序列3所示，轻链可变区含有三个CDR区域(CDR1、CDR2和CDR3依次为序列表的序列3自N末端第44-54位氨基酸残基、第70-76位氨基酸残基和第109-117位氨基酸残基)。VEGFR2特异抗体的轻链的编码序列如序列表的序列4所示。实施例2、重组细胞的获得一、重组质粒的构建1、合成编码VEGFR2特异抗体的重链的DNA分子(序列表的序列2所示的双链DNA分子)并将其作为模板，采用H-F和H-R组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。H-F：GGCAAAGAATTCGCCGCCACCATGGAACTGGGGCTCCGCTG；H-R：GAGCTCGAATTCCTATTTACCCGGAGACAGGGAG。本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种IgG，其重链由重链可变区和重链恒定区组成，其轻链由轻链可变区和轻链恒定区组成；所述重链可变区中的CDR1、CDR2和CDR3依次为序列表的序列1自N末端第45‑54位氨基酸残基、第69‑85位氨基酸残基和第118‑124位氨基酸残基；所述轻链可变区中的CDR1、CDR2和CDR3依次为序列表的序列3自N末端第44‑54位氨基酸残基、第70‑76位氨基酸残基和第109‑117位氨基酸残基。

【技术特征摘要】
1.一种IgG，其重链由重链可变区和重链恒定区组成，其轻链由轻链可变区和轻链恒定区组成；所述重链可变区中的CDR1、CDR2和CDR3依次为序列表的序列1自N末端第45-54位氨基酸残基、第69-85位氨基酸残基和第118-124位氨基酸残基；所述轻链可变区中的CDR1、CDR2和CDR3依次为序列表的序列3自N末端第44-54位氨基酸残基、第70-76位氨基酸残基和第109-117位氨基酸残基。2.如权利要求1所述的IgG，其特征在于：所述重链为序列表的序列1所示的多肽；所述轻链为序列表的序列3所示的多肽。3.编码权利要求2所述IgG的基因，其特征在于：编码所述重链的基因为如下(1)或(2)：(1)序列表的序列2自5’末端第10-1398位核苷酸所示的DNA分子；(2)序列表的序列2所示的DNA分...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨春，原野，洪海燕，李小雯，叶宇，
申请(专利权)人：北京步长新药研发有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11