一种合成百草枯抗原的方法及其应用技术

本发明专利技术建立了一种合成百草枯抗原的方法和应用多克隆抗体检测百草枯的直接竞争ELISA试剂盒的构建方法。试剂盒的组成包括：百草枯酶标物、百草枯标准液、包被百草枯多克隆抗体的酶标板、底物显色液、洗涤液、终止液、酶标物稀释液及样品稀释液等。本发明专利技术建立了人工合成百草枯抗原的方法，以BSA为载体制备多克隆抗体；应用多克隆抗体制备的ELISA试剂盒，具有简单、快速、处理样品量大、灵敏度较高、特异性强和价格低廉等诸多优点，适合工厂化生产，可对大豆等农产品中百草枯进行快速检测。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种合成百草枯抗原的方法，尤其是提供了应用多克隆抗体术研制的检测百草枯的直接竞争ELISA试剂盒，同时还公开了其制备方法，属于酶联免疫

技术介绍
百草枯(paraquat，PQ)，化学名为1，I' - 二甲基_4，4'-联吡啶阳离子盐，是一种联吡啶类灭生性除草剂，广泛应用于园林除草、非耕地化学除草，能杀灭大部分禾本科及阔叶杂草，绿叶接触药液数小时后便开始枯死。药液接触土壤后能被土壤胶体迅速、强烈吸附，并完全钝化而不影响作物根部。 人百草枯急性中毒后肺毛细血管损伤、肺泡性肺水肿，最后是肺纤维化急性爆发性百草枯中毒(> 40ml)患者很快发生多器官衰竭，死亡率高达100% ;中重度中毒(20 40ml)可导致急性肾功能衰竭，重度中毒还可并发肺纤维化及中毒性肝炎，并多于中毒后2 3周死亡；而轻度中毒者(< 20ml)多表现为口腔及胃肠道粘膜灼伤，症状有恶心、呕吐、腹泻、肠胃，多数可以痊愈。国外早在上世纪70年代就开始对百草枯的检测方法进行研究，近年来在这方面的研究工作取得了较快的进展。高灵敏度的仪器分析法和快速有效的免疫分析法正逐渐被应用于百草枯的检测。国内起步较晚，而且对于食品中百草枯的快速检测未受到足够的重视。国内起步较晚，而且对于百草枯的快速检测未受到足够的重视。目前已有的测定方法可概括为三类活生物体分析法、仪器分析法、免疫化学分析法。生物体分析法是从自然界筛选对生长环境中有毒化合物敏感的物种，作为环境监测的工具。Rioboo等用淡水微藻C. Moewusii和C. Vulgaris检测水中百草枯和乙丙隆。最低检测浓度定为使生长率降低50% 的浓度(EC50)，百草枯对 C. Moewusii 的 EC50 为 O. 28 μ mol/L,乙丙隆对 C. Vulgaris的EC50为O. 15ymol/L0用于测试的生物一般生活周期短，容易操作，检测成本低。可考虑作为一种在基层应用的大面积生态环境监测手段。Khan SU利用气相色谱(GC)检测莴苣、萝卜和洋葱中的百草枯，用5M H2S04提取样品中的PQ并对提取物催化加氢，然后进行氧化铝柱纯化后进行GC检测。加标O. 5、O. I和O. 05ppm时，回收率在75 86 %，绝对误差最高为4%，最低检出限在O. 05ppm左右。液相色谱适用于检测热稳定性差，极性强、分子量大、不易挥发的化合物及离子型化合物。百草枯是一种极性很强的离子型化合物，比较适合用HPLC进行分析。自20世纪80年代以来，液相色谱法占据了主导地位，并与质谱联用，广泛应用于水体、人血浆和血清等生物检材中百草枯的检测。有学者直接采用紫外分光光度法进行测定，检出限为O. 01 μ g/mL,回收率为90. 0% 102. 4%，操作简便快速，适合于临床上肝中百草枯浓度的测定。Masafumi Tomita利用毛细管电泳同时检测血清中的对草快(PQ)和敌草快(DQ)，检测灵敏度为O. 05 μ g/mL。此后十多年，许多国外学者将毛细管电泳用于血清、水等样品中百草枯的检测。由于百草枯的沸点比较高，极性强，需要对样品进行特殊的衍生或裂解处理后才能进行检测，操作比较复杂，用气相色谱分析比较困难。因此，利用GC进行检测的报道较少。薄层层析法可利用特殊的显色剂观察斑点颜色和利用Rf值来定性，其测定准确性较差，检测灵敏度不高，因此只能用于半定量分析。免疫分析是以抗原与抗体的特异性结合为基础，其原理是利用生物分子识别，灵敏度高，特异性强，故在临床医学上有极其重要的地位。酶联免疫法(Enzyme Immunoassay,EIA)是将抗原、抗体的特异性免疫反应和酶的高效催化作用有机结合起来的一种免疫分析方法。酶免疫法的检测原理与放射免疫法类似，通过测定结合于固相的酶的活力来测定被测定物的量。用作标记物的酶有辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase, HRP)和碱性磷酸酶(Alkaline Phosphatase)。酶标试剂制备容易、稳定、价廉。酶免疫分析的灵敏度接近放射免疫技术，而可借助于简单的仪器作定量测定，是目前农药监测中应用最广泛的免疫分析技术。本专利技术的百草枯的ELISA检测试剂盒避免了现有检测手段存在的问题，相比较其他的检测手段，建立的百草枯ELISA试剂盒检测方法具有特异性强、敏感度高、检测周期短、操作简单方便，可大量生产等的特点。
技术实现思路
本专利技术公开一种合成百草枯抗原的方法，可用于制备多克隆抗体。本专利技术还提供了应用多克隆抗体检测百草枯的直接竞争ELISA检测试剂盒的制备方法，适合工厂化生产。本专利技术公开的人工合成百草枯抗原是通过以下方法得到的免疫抗原PQ-h-BSA的制备43mgBSA溶于3ml水中，用0. IM的NaOH调pH至9. O。9mgN-甲基-N'-戊酸基-二吡啶阳离子化合物(PQ-h)溶于500 U I 二噁烷中，进行超声处理。加入无水三正丁胺^^匕将此混合物在口^冰浴中冷却’并搅拌^!^!!。加入重蒸的氯甲酸异丁酯8iU，15°C以下搅拌30min。将搅拌后的PQ_h溶液逐滴加入到溶解的蛋白中，并于4°C轻微搅拌4h，整个过程维持pH在9. O。然后，将混合物于4°C在0. IM的PBS中透析72h，每隔6h换透析液一次。冷冻干燥后于-20°C保存。包被抗原PQ-h-OVA的制备28mg OVA溶于3ml水中，用0. IM的NaOH调pH至9. O。9mgN-甲基-N'-戊酸基-二吡啶阳离子化合物(PQ-h)溶于500 U I 二噁烷中，进行超声处理。加入无水三正丁胺15 u I，将此混合物在12°C冰浴中冷却，并搅拌15min。加入重蒸的氯甲酸异丁酯8 yl，15°C以下搅拌30min。将搅拌后的PQ_h溶液逐滴加入到溶解的OVA中，并于4°C轻微搅拌4h，整个过程维持pH在9. O。然后，将混合物于4°C在0. IM的PBS中透析72h，每隔6h换透析液一次。冷冻干燥后于-20°C保存。N-甲基-N'-戊酸基-二吡啶阳离子化合物(PQ-h)的合成方法4，4-联吡啶和碘甲烷(CH3I)以摩尔比1.05 I在无水丙酮中反应，4°C，磁力搅拌，于密闭三颈圆底烧瓶通氮气保护下在暗处反应。反应混合物完全加入后，低温(4V左右)搅拌过夜。过滤，用无水丙酮洗涤，抽干，得产品N-甲基-二吡啶阳离子化合物(MQ)，真空干燥，得黄色针状结晶，然后存放于真空干燥器中。将得到的MQ和5-溴戊酸乙酯以摩尔比I : 2混合，120°C油浴，磁力搅拌，在新鲜蒸馏的无水二甲基甲酰胺(DMF)中回流5h，然后室温放置过夜。抽滤，用无水DMF洗涤，真空干燥，得黄色片状结晶N-甲基-N'-戊酸乙酯基-二吡啶阳离子化合物，存放于真空干燥器中。将得到的N-甲基-N'-戊酸乙酯基-二吡啶阳离子化合物与适量浓HCl混合，加热回流3h左右。在旋转蒸发器上蒸去过量的酸和水，保持水浴温度不超过60°C，蒸干，得固体残留物。冷却后，加入少量丙酮结晶(析出白色晶体)，过滤，抽干，真空干燥，得粗品，再经95 %乙醇重结晶，真空干燥，得到高纯度N-甲基-N'-戊酸基-二吡啶阳离子化合物。本专利技术还提供了一种ELISA检测试剂盒，具体而言其组成如下百草枯酶标物、百本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：孙秀兰，尤继明，李红梅，郑佳玉，张弓，纪剑，田秀梅，张银志，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：