猪TLR4多克隆抗体的制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种猪TLR4多克隆抗体的制备方法，将重组TLR4蛋白(抗原)与弗氏佐剂乳化后免疫动物获得多克隆抗体血清；其中，重组TLR4蛋白具有序列表SEQ.ID.No.1氨基酸序列。试验表明，本发明专利技术制备的抗体反应性和特异性良好，由于TLR4基因是针对固有免疫应答的重要模式识别受体Toll样受体家族的成员，其在抗细菌性和病毒性感染疾病中发挥重要的作用，因此本发明专利技术可应用于猪TLR4蛋白的检测及相关研究，为研究猪细菌性和病毒性感染疾病与TLR4的相互作用机理以及病毒免疫逃避机制的打下良好基础，为新型疫苗和药物的研制提供新的靶标。同时，本发明专利技术构建的原核表达载体表达重组蛋白效率高，分离纯化方法简单易操作。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于多克隆抗体制备
，尤其涉及一种猪TLR4多克隆抗体的制备方法和应用。
技术介绍
TLR4属于I型跨膜蛋白，是TLR家族中极为重要的成员，是固有免疫系统识别病原微生物的主要受体。TLR4可识别革兰氏阴性菌的脂多糖而在细菌感染性疾病的发生中起重要作用。近年来越来越多的研究发现，TLR4还广泛参与病毒感染性疾病的发生和病毒的免疫逃逸。TLR4是TLR家族中唯一一个能利用四种接头分子(MyD88、MAL/TIRAP、TRIF和TRAM)传递级联信号的受体，通过下游IRAK以及TAF3和TRAF6，活化转录调节因子，如NF-κB、AP-1和一系列的干扰素调节因子，引起炎性因子和I型干扰素的产生，启动固有免疫和获得性免疫应答。近年来，抗病毒固有免疫研究已经取得了重要进展，针对固有免疫应答的重要模式识别受体——Toll样受体(Toll-like receptor，TLR)所研制的新型疫苗和治疗药物已经在临床上用于HIV、HBV和HCV的防治。在研究猪细菌性以及病毒性疾病与TLR4(猪Toll样受体4，Toll-like receptors 4)相互作用过程中，需要运用到Western-blot、IFA、Co-IP以及FCM等多种实验方法，而这些研究方法无一不需要抗猪TLR4多克隆抗体作为支撑，生物市场上猪源抗体的缺乏严重制约着猪TLR4的相关研究。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种猪TLR4多克隆抗体的制备方法，用于研究猪细菌性和病毒性疾病的感染机制，并通过揭示该蛋白抗细菌及病毒的机制，为开发新型疫苗或药物提供依据。为解决上述技术问题，本专利技术采用以下技术方案：猪TLR4多克隆抗体的制备方法，将重组TLR4蛋白(抗原)与弗氏佐剂乳化后免疫动物获得多克隆抗体血清；重组TLR4蛋白具有序列表SEQ.ID.No.1氨基酸序列。免疫动物按以下操作进行：采用第1、7、21、35天背部皮下多点注射的方式免疫8只4周龄昆明小白鼠；首免时，重组蛋白与等量的弗氏完全佐剂混合乳化，每只小鼠蛋白免疫量约500μg；后续免疫则采用等量的弗氏不完全佐剂与重组蛋白进行乳化每只小鼠蛋白免疫量约300-500μg。重组TLR4蛋白是由IPTG诱导基因工程菌表达目的蛋白，并通过低浓度尿素溶液多次洗涤包涵体获得(纯度较高的重组TLR4蛋白)。基因工程菌由TLR4原核表达载体转化至大肠杆菌Rosetta(DE3)获得；TLR4原核表达载体是由RT-PCR获得并构建含有序列表SEQ.ID.No.1碱基序列的重组载体，通过PCR获得序列表SEQ.ID.No.2碱基序列连接至原核表达质粒pET-32a(+)构建而成。上述制备方法获得的猪TLR4多克隆抗体。猪TLR4多克隆抗体在制备抗猪瘟病毒疫苗或药物方面的应用。针对目前缺乏抗猪TLR4多克隆抗体用于研究猪细菌性以及病毒性疾病的现状，专利技术人建立了一种猪TLR4多克隆抗体的制备方法，将重组TLR4蛋白(抗原)与弗氏佐剂乳化后免疫动物获得多克隆抗体血清；其中，重组TLR4蛋白具有序列表SEQ.ID.No.1氨基酸序列。试验表明，本专利技术制备的抗体反应性和特异性良好，由于TLR4基因是针对固有免疫应答的重要模式识别受体Toll样受体家族的成员，其在抗细菌性和病毒性感染疾病中发挥重要的作用，因此本专利技术可应用于猪TLR4蛋白的检测及相关研究，为研究猪细菌性和病毒性感染疾病与TLR4的相互作用机理以及病毒免疫逃避机制的打下良好基础，为新型疫苗和药物的研制提供新的靶标。同时，本专利技术构建的原核表达载体表达重组蛋白效率高，分离纯化方法简单易操作。附图说明图1是TLR4-KZ大片段DNA PCR电泳图，图中：M：DNA Marker DL2000，1：TLR4-KZ大片段DNA PCR产物。图2是原核表达质粒PCR(左)和EcoR I/Not I双酶切电泳图(右)，图中：M：DNA Marker DL2000/5000，1：原核表达质粒PCR产物，2：原核表达质粒双酶切产物。图3是SDS-PAGE分析重组菌pET-TLR4(170)表达的TLR4结果，图中：M：非预染蛋白Marker，1：未进行诱导的重组菌菌体2：0.05mM IPTG 30℃诱导重组菌6h后收集的菌体，3和4：分别为0.05mM IPTG 30℃诱导重组菌6h后裂解菌体得到的上清和沉淀。图4是重组蛋白HIS标签的检测，图中：M：预染蛋白Marker。图5是多克隆抗体与重组蛋白反应性的检测结果图，图中：M：预染蛋白Marker。图6是多克隆抗体应用的检测结果图，图中：M：预染蛋白Marker，0-48h.p.i分别是PK-15细胞感染猪瘟病毒0、12、24、36和48h后收集的细胞总蛋白。具体实施方式实施例1构建TLR4原核表达载体和基因工程菌。根据GenBank中Sus scrofa toll-like receptor 4(TLR4)mRNA(登录号：KF460453.1)氨基酸序列分析其亲疏水性及线性表位，确定原核表达基因序列为2043-2052共510bp，核苷酸序列和氨基酸序列分别如S序列表SEQ.ID.No.3和序列表SEQ.ID.No.1所示，并设计目的基因的克隆引物F1/R1和原核表达引物F2/R2。采集感染猪瘟病毒的PK-15细胞，抽提细胞总RNA并反转录，利用引物F1/R1扩增出TLR4-KZ大片段(621bp)(图1)，其核苷酸序列如序列表SEQ.ID.No.2所示。以TLR4-KZ质粒为模板，利用引物F2/R2PCR扩增得到原核表达序列TLR4(170)，其核苷酸序列如序列表SEQ.ID.No.3所示。反转录体系如下：RNA模板15μL，Oligo dT 1μL，M-MLV反转录酶1μL，5×first buffer 5μL，RNase inhibitor 1μL，dNTP 2μL。反转录程序为42℃1h，95℃5min。PCR反应体系如下：模板2μL，2×Taq PCR Mastermix 12.5μL，上游引物和下游引物各0.5μL，ddH2O 9.5μL。PCR程序如下：95℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，循环30次；72℃终延伸10min。反应结束后进行DNA琼脂糖凝胶电泳分析，并回收目的基因片段，与pMD18-T载体连接，所获得质粒经华大基因公司测序确认与GenBank中目的基因序列一致。设计的克隆引物：F1：5’-GCCGTCATTAGTGCGTCAGTT-3’(SEQ.ID.No.4)，R1：5’-GGCTGTTGTATCATGCTGGTTGCT-3’(SEQ.ID.No.5)。原核表达引物：F2：5’-CGGAATTCTATGGCAGAGGTGAAAGC-3’(SEQ.ID.No.6)，R2：5’-CGGCGGCCGCATGATGATGATGATGATGTGTATCATGCTGGTTGCT-3’(SEQ.ID.No.7)。(下划线分别为核酸限制性内切酶EcoR I和Not I识别位点)将所获得的目的基因质粒和原核表达质粒pET-32a(+)同时用核酸限制性内切酶EcoR I和Not I进行双酶切，纯化酶切产物后，通过T4DNA li本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种猪TLR4多克隆抗体的制备方法，其特征在于将重组TLR4蛋白与弗氏佐剂乳化后免疫动物获得多克隆抗体血清；所述重组TLR4蛋白具有序列表SEQ.ID.No.1氨基酸序列。

【技术特征摘要】
1.一种猪TLR4多克隆抗体的制备方法，其特征在于将重组TLR4蛋白与弗氏佐剂乳化后免疫动物获得多克隆抗体血清；所述重组TLR4蛋白具有序列表SEQ.ID.No.1氨基酸序列。2.根据权利要求1所述的猪TLR4多克隆抗体的制备方法，其特征在于所述免疫动物按以下操作进行：采用第1、7、21、35天背部皮下多点注射的方式免疫8只4周龄昆明小白鼠；首免时，重组蛋白与等量的弗氏完全佐剂混合乳化，每只小鼠蛋白免疫量约500μg；后续免疫则采用等量的弗氏不完全佐剂与重组蛋白进行乳化每只小鼠蛋白免疫量约300-500μg。3.根据权利要求1所述的猪TLR4多克隆抗体的制备方法，其特征在于...

【专利技术属性】
技术研发人员：罗廷荣，赵倩楠，李晓宁，李晓泉，应雪，陶倩，姜炳星，
申请(专利权)人：广西大学，
类型：发明
国别省市：广西;45