本发明专利技术属本发明专利技术属于免疫分析技术领域。具体涉及阪崎肠杆菌多克隆抗体的高效制备方法。本发明专利技术采用皮下多点注射与耳缘静脉注射相结合的方法用阪崎肠杆菌颗粒性抗原免疫新西兰大白兔，抗血清用ProteinA亲和层析柱一步纯化，快速获得高了效价的阪崎肠杆菌多克隆抗体。与传统的免疫方法相比不仅能减少7-14天的免疫时间，而且抗体效价大大提高。同时用West-blotting与IFAT结合的方法检测了抗体的特异性，结果表明所制备的抗体对阪崎肠杆菌具有很高的特异性。方法简单高效，为阪崎肠杆菌多克隆抗体的制备提供技术支持，有助于阪崎肠杆菌免疫检测技术的发展。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于免疫分析
具体涉及高效制备阪崎肠杆菌多克隆抗体的方法。
技术介绍
阪崎肠杆菌（E.sakazakii）属于兼性厌氧革兰氏阴性杆菌，由其引发的新生儿脑膜炎、脓毒病和坏死性小肠结肠炎散发和爆发的病例在世界范围内多有报道，致死病例高达40％～80％。受感染的主要是住院的初生婴儿，尤其是早产或患有其他疾病的婴儿。目前各国已将阪崎肠杆菌（E.sakazakii）作为婴幼儿配方奶粉中必需检测的卫生指标。传统的检测方法具有检测步骤繁琐、检测周期长等缺点，因此建立阪崎肠杆菌的快速检测方法是防控阪崎肠杆菌感染的关键。基于抗原与抗体间特异性反应的免疫学技术检测致病菌具有快速、灵敏和高特异性的特点。免疫学检测致病菌的关键是首先具有高效价的多克隆或单克隆抗体。单克隆抗体虽然特异性高，但制备过程复杂且易受污染；多克隆抗体制备过程简单，但传统的皮下多点注射免疫方法耗时长，效价和纯度较低。本专利技术建立了新西兰大白兔皮下多点注射结合耳缘静脉注射的免疫方法制备多克隆抗体；与传统皮下注射免疫相比，不仅缩短了免疫时间，而且大大提高了多克隆抗体的效价；利用ProteinA亲和层析柱一步纯化多克隆抗体，获得高效价高纯度的抗体，完全能满足免疫检测的需要。目前还没有专利和文章涉及本专利技术中的免疫技术制备阪崎肠杆菌多克隆抗体的报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种快速高效制备阪崎肠杆菌多克隆抗体的方法。采用皮下多点注射与耳缘静脉注射相结合的方法用阪崎肠杆菌免疫新西兰大白兔，抗血清在免疫24~28天后即可获得。采用proteinA亲和柱一步纯化多克隆抗体，纯化后的效价高达1:40960，完全满足免疫检测的需求。与传统的免疫方法相比能减少7-14天的免疫时间。用Western-blotting和间接免疫荧光检测(indirectimmunoflu-orescenceassaytest，IFAT)相结合的方法对制备的多克隆抗体的特异性进行了鉴定。本专利技术制备多克隆抗体的方法新颖、简单，高效。可以为致病菌多克隆抗体的制备及阪崎肠杆菌免疫快速检测开拓一片新领域。
本专利技术是一种阪崎肠杆菌多克隆抗体的高效制备方法，其特征在于建立了一种新的免疫方法来高效制备多克隆抗体。制备步骤分为如下四步：
（一）抗原的制备
阪崎肠杆菌（Enterobactersakazakii)37℃培养24h活化菌种。用无菌水洗下菌苔，并洗涤三次，用比浊法测定细菌浓度1×107~1×109cfu/ml;福尔马林4℃灭活后离心去除福尔马林，沉淀用等体积无菌水重新悬浮获得阪崎肠杆菌颗粒型抗原。
（二）抗血清的制备
新西兰大白兔适应性饲养一周后，耳静脉采血5~10mL，作为阴性血清。用步骤（一）灭活后的阪崎肠杆菌颗粒性抗原免疫新西兰大白兔，采用皮下多点注射与耳缘静脉注射相结合的方法免疫。间隔10~14天进行第二次免疫，再隔7天进行第三次加强免疫。第三次加强免疫后第3~6天耳静脉采血测效价，当效价＞1:5120时；颈动脉一次性采血，室温放置1h，转入4℃过夜；次日4℃5000rpm离心20~30min得抗血清，4℃保存备用。
（三）多克隆抗体的纯化
采用ProteinA亲和层析柱纯化抗体，用5~10倍柱体积的去离子水洗出保护剂溶液。然后用5~10倍柱体积的的PBS缓冲液平衡柱子，再将步骤（二）获得的血清样品1ml上柱。用5~10倍体积的PBS缓冲液洗脱杂蛋白。再用5~10倍体积的甘氨酸缓冲液洗脱阪崎肠杆菌多克隆抗体，收集洗脱峰。
（四）多克隆抗体的特异性检测
阪崎肠杆菌悬液先进行SDS-PAGE电泳。取出凝胶进行West-blot检测，凝胶转移到电泳转移槽后，加入转移缓冲液，与硝酸纤维素膜(NC膜)贴紧，夹于3层滤纸、两张多孔垫料之间。转膜后取出NC膜，用牛血清白蛋白封闭，依次连接上第一抗体（兔多克隆抗体）和碱性磷酸酶标记的第二抗体，最后将膜置于新鲜配制的NBT/BCIP发色液中发色，晾干后观察。
间接免疫荧光检测(indirectimmunoflu-orescenceassaytest，IFAT)进一步验证多克隆抗体的特异性。将阪歧肠杆菌培养液按不同倍数稀释，分别取不同浓度的菌悬液l滴于载玻片上，在超净工作台中风干。风干后丙酮固定15min；依次连接上第一抗体（兔多克隆抗体）和FITC标记的第二抗体，在荧光显微镜下观察菌体的发光情况。
附图说明
图1为多克隆抗体的ProteinA亲和层析柱的纯化结果
图2为多克隆抗体的West-blotting检测结果
图3为多克隆抗体的间接免疫荧光检测结果。
具体实施方式
实例1（一）抗原的制备
阪崎肠杆菌（Enterobactersakazakii)划线牛肉膏蛋白胨(CM0002)固体培养基，37℃培养24h活化菌种。用无菌水洗下菌苔，并洗涤三次，用比浊法调节细菌浓度为1×107cfu/ml；福尔马林4℃灭活24h，涂布平板37℃培养24h，若无活菌，在4℃下12000rpm离心10min去除福尔马林，沉淀用等体积无菌水重悬获得阪崎肠杆菌颗粒性抗原。
（二）抗血清的制备
新西兰大白兔适应性饲养一周后，耳静脉采血5~10mL，作为阴性血清。用灭活后的阪崎肠杆菌颗粒性抗原免疫新西兰大兔，具体程序如下：基础免疫，0.7ml抗原与弗氏完全佐剂1:1混匀，颈背部皮下多点注射，每点注射0.1ml，耳缘静脉注射0.1ml；10~14天后0.8ml抗原与弗氏不完全佐剂1:1混匀，颈背部和腹股沟皮下多点注射，每点注射0.1ml，耳缘静脉注射0.2ml；再隔7天后1.2ml抗原与弗氏完全佐剂1:1混匀；颈背部皮下和足掌多点注射，每点注射0.1ml，耳缘静脉注射0.3ml；第3次加强免疫后第3~6天耳静脉采血测效价，当效价＞1:5120时，颈动脉一次性采血，室温放置1h，转入4℃过夜；次日4℃5000rpm离心20~30min得抗血清，4℃保存备用。
（三）多克隆抗体的纯化
ProteinA亲和层析柱纯化：将1ml的ProteinA亲和层析柱固定在AKTA蛋白纯化仪上。用5~10倍柱体积的去离子水洗出保护剂溶液。然后用5~10倍柱体积的pH7.4的PBS缓冲液平衡柱子，直至洗出液与起始缓冲液pH相同时，将1ml血清样品上柱。用5~10倍体积的pH7.4的PBS缓冲液洗脱杂蛋白。用5~10倍体积的pH2.7的甘氨酸缓冲液洗脱阪崎肠杆菌多克隆抗体，收集洗脱峰，每管加入50μLpH9.0的Tris-HCL缓冲液。
（四）多克隆抗体的特异性检测
阪崎肠杆菌悬液先进行SDS-PAGE电泳。取出凝胶进行West-blot检测，凝胶转移到电泳转移槽后，加入转移缓冲液，与硝酸纤维素膜(NC膜)贴紧，夹于3层滤纸、两张多孔垫料之间。转膜后取出NC膜，用牛血清白蛋白封闭，依次连接上第一抗体（兔多克隆抗体）和碱性磷酸酶标记的第二抗体，最后将膜置于新鲜配制的NBT/BCIP发色液中发色，晾干后观察。
间接免疫荧光检测(indirectimmunoflu-orescenceassaytest，IFAT)进一步验证多克隆抗体的特异性。将阪歧长杆菌培养液按不同倍数稀释，分别取不同浓度的菌悬液l滴于载玻片上，本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种阪崎肠杆菌多克隆抗体的高效制备方法，其特征在于，采用皮下多点注射与耳缘静脉注射相结合的方法用阪崎肠杆菌免疫新西兰大白兔制备抗血清，并用Protein A亲和层析柱一步纯化抗体。
【技术特征摘要】
1.一种阪崎肠杆菌多克隆抗体的高效制备方法，其特征在于，采用皮下多点注射与耳缘静脉注射相结合的方法用阪崎肠杆菌免疫新西兰大白兔制备抗血清，并用ProteinA亲和层析柱一步纯化抗体。
2.具体的制备方法由如下步骤组成：
步骤一：抗原的制备
将浓度为1×107cfu/ml~1×109cfu/ml的阪崎肠杆菌用3%~10%的福尔马林灭活，4℃~37℃灭活后离心去除福尔马林，涂布平板进行无菌检验，无菌生长方可使用，沉淀用等体积无菌生理盐水重新悬浮获得阪崎肠杆菌颗粒性抗原；
步骤二：抗血清的制备
新西兰兔适应性饲养一周后，耳静脉采血5~10mL，保留血清，作为阴性血清，用步骤（一）灭活后的阪崎肠杆菌颗粒性抗原免疫新西兰兔，采用皮下多点注射与耳缘静脉注射相结合的方法；间隔10~14天进行第二次免疫，再间隔7天进行第三次加强免疫；
第三次加强免疫后第3~6天耳静脉采血测效价，当效价＞1:5120时，颈动脉一次性采血，室温放置1h，转入4℃过夜；次日4℃5000rpm离心20~30min得抗血清，4℃保存备用；
步骤三：多克隆抗体的纯化
将1ml的ProteinA亲和层析柱固定在AKTA蛋白纯化仪上，采用ProteinA亲和层析柱纯化抗体；用5~10倍柱体积的去离子水洗出保护剂溶液，然后用5~10倍柱体积的的PBS缓冲液平衡柱子；再将步骤（二）获得的血清样品1ml上柱，用5~10倍体积的PBS缓冲液洗脱杂蛋白；再用5~10倍体积的甘氨酸缓冲液或柠檬酸钠缓冲液或柠檬酸缓冲液洗脱阪崎肠杆菌多克隆抗体，收集洗脱峰；
步骤四：多克隆抗体的特异性检测，West-blotting检测验证多克隆抗体的特异性；阪崎肠杆菌悬液先进行SDS-PAGE电泳，取出凝胶转移到电泳转移槽后，加入转移缓冲液，与硝酸纤维素膜(NC膜)贴紧，夹于3层滤纸、两张多孔垫料之间；转膜后取出NC膜，用牛血清白蛋白封闭，依次连接上第一抗体（兔多克隆抗体）和碱性磷酸酶标记的第二抗体，最后将膜置...
【专利技术属性】
技术研发人员：汪东风，朱英莲，徐莹，
申请(专利权)人：中国海洋大学，
类型：发明
国别省市：山东;37
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