本发明专利技术公开了一种侵染淮山药的马铃薯X病毒属病毒——淮山药X病毒（Yam?virus?X，YVX）的多克隆抗体制备、检测及其应用。基于YVX基因组，发明专利技术人通过原核表达纯化YVX的外壳蛋白（Coat?protein，CP）并用于免疫家兔制备多克隆抗体，该多克隆抗体能特异性识别原核表达的YVX的外壳蛋白和侵染淮山药的YVX病毒的外壳蛋白，并产生特异性免疫反应。基于此，发明专利技术人还建立了一套高效、高灵敏和准确的IC-RT-PCR、ELISA和Western?blot方法，可以特异性地从感染YVX的淮山药植株中检测出YVX。应用本发明专利技术，可为YVX与寄主相互作用研究以及该病毒的快速检测、分型和分子生物学研究提供物质基础和技术支撑，为该病毒的流行监测和防治打下扎实基础。
Huaishan medicine X virus polyclonal antibody preparation, detection and Application
The invention discloses an infected yam potato virus X virus, X virus Rhiizoma Dioscoreae (Yam? Virus? X, YVX) polyclonal antibody preparation, detection and application. Based on the YVX genome, the inventor expression of coat protein purified by YVX prokaryotic (Coat? Protein, CP) and used to immunize rabbit to prepare polyclonal antibody. The polyclonal antibody to coat protein and infection of yam specific recognition of prokaryotic expression of YVX YVX capsid protein, and produce specific immune reaction. Based on this, the inventor has also established a set of efficient, sensitive and accurate IC-RT-PCR, ELISA and Western? Blot method can detect specific plants infected with YVX from Dioscorea opposita Thunb in YVX. The application of the invention, for the study of the interaction between YVX and host, and rapid detection of the virus type and molecular biology research provides the material basis and the technical support for monitoring and prevention of the epidemic virus to lay a solid foundation.
【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术公开了一种侵染淮山药的马铃薯X病毒属病毒——淮山药X病毒（Yam?virus?X，YVX）的多克隆抗体制备、检测及其应用。基于YVX基因组，专利技术人通过原核表达纯化YVX的外壳蛋白（Coat?protein，CP）并用于免疫家兔制备多克隆抗体，该多克隆抗体能特异性识别原核表达的YVX的外壳蛋白和侵染淮山药的YVX病毒的外壳蛋白，并产生特异性免疫反应。基于此，专利技术人还建立了一套高效、高灵敏和准确的IC-RT-PCR、ELISA和Western?blot方法，可以特异性地从感染YVX的淮山药植株中检测出YVX。应用本专利技术，可为YVX与寄主相互作用研究以及该病毒的快速检测、分型和分子生物学研究提供物质基础和技术支撑，为该病毒的流行监测和防治打下扎实基础。【专利说明】淮山药X病毒的多克隆抗体制备、检测及其应用
本专利技术属于基因工程
，具体涉及一种侵染淮山药的马铃薯X病毒属病毒一淮山药X病毒的多克隆抗体制备、检测及其应用。
技术介绍
淮山药又称山药、淮山，为薯蓣科植物，其块根富含淀粉、蛋白质、维生素、氨基酸及多种药用成分如胆碱、皂甙、粘多糖等，还含有Fe、Zn、Cu、Ca等多种矿物质，依据种和品种的不同，可作药用或食用，具有良好市场前景和产业开发潜势。病毒病严重影响淮山药的产量和品质，在淮山药生产上造成重大损失。文献表明，全球范围内，自然条件下侵染淮山药的病毒有杆状DNA病毒属的参暮杆状病毒(Dioscorea alata bacilliform virus,DaBV)、淮山药花叶病毒(Yam mosaic virus, YMV)、淮山药温和花叶病毒(Yam mild mosaicvirus, YMMV)、中 国淮山药坏死花叶病毒(Chinese yam necrotic mosaic virus, CYNMV)、日本淮山花叶病毒(Japanese yam mosaic virus, JYMV)、香豆萎蔫病毒 2 (Broad bean wiltvirus-2, BBWV-2)。我国已发现DaBV、YMMV、JYMV、CYNMV和BBWV-2侵染淮山药，引发的症状包括花叶、斑驳、脉明、褪绿、生长迟缓和叶片扭曲等。不同淮山药病毒引起症状不同，也可以引起相似症状；其传播介体不一样，有不同的传播途径。为了保证淮山药生产的正常进行，首先要保证种薯不携带病毒，其次是在生产大田及时发现和鉴定病毒，以便制定有针对性的防治措施，包括控制传播介体来切断病毒病的传播。因此，要求有灵敏度高、特异性好的病毒检测技术来对淮山药的种薯和田间样本进行检测。目前，用于植物RNA病毒病原检测的主要技术手段有 RT-PCR、IC-RT-PCR、qRT-PCR、LAMP-PCR、ELISA、Western blot 等，在病毒病原检疫检测方面应用最多的是ELISA和qRT-PCR。近年来对中国各主要淮山产区的调查中，发现侵染淮山药的一个新病毒一分类上属于马铃薯X病毒属(Potexvirus)病毒,暂定名为淮山药X病毒(Yam virus X, YVX)?
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种淮山药X病毒的多克隆抗体制备、检测及其应用，以便用于快速检测侵染淮山药的淮山药X病毒。为解决上述技术问题，本专利技术采用以下技术方案:淮山药X病毒的多克隆抗体制备方法，原核表达纯化淮山药X病毒的CP蛋白(Coat Protein)并用于免疫家兔制备多克隆抗体。淮山药X病毒的CP蛋白具有序列表SEQ.1D.N0.1的氨基酸序列，或由具有序列表SEQ.1D.N0.2的碱基序列的基因所编码。上述多克隆抗体制备方法，取纯化后的重组CP蛋白，采用皮下多点注射法免疫新西兰大白兔，以后每2周加强免疫一次，共免疫4次；首次免疫加入与蛋白等量的弗氏完全佐剂，后3次加入与蛋白等量的弗氏不完全佐剂；末次加强免疫7天后，心脏采血，分离血清；再用抗原亲和层析纯化获得该病毒外壳蛋白CP的多克隆抗体。所得淮山药X病毒的多克隆抗体在检测淮山药X病毒方面的应用。基于上述多克隆抗体的淮山药X病毒的ELISA检测方法。上述ELISA检测方法，包括以下步骤:(I)用ImL抗原包被缓冲液研磨0.1g淮山药新鲜叶片，9000rpm离心5min,取上清液稀释20倍，按照100 μ I/孔加入ELISA板；感染YVX的淮山药病叶为阳性对照，相应健康叶为阴性对照，37 °C孵育2h;(2)用200 μ I PBST洗涤两次后，用5%脱脂奶粉封闭30min ；(3)用200 μ I PBST洗涤两次后，每个孔中加入用抗体稀释缓冲液按照1:8000稀释的多克隆抗体，100 μ I/孔，37°C孵育Ih或室温孵育3h ；(4)用200 μ I PBST洗涤两次后，每个孔中加入按说明书稀释3000倍的辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG结合物，100 μ I/孔，室温孵育Ih ；(5)用200 μ I PBST洗涤三次后，用TMB底物显色试剂盒(康为世纪公司)进行显色，室温避光孵育25-30min，反应产物呈蓝色，每孔再加入50 μ 10.5Μ H2SO4终止显色，此时蓝色产物变为亮黄色，立即用酶标仪读取OD45tl的值，以与阴性OD值比值(Ρ/Ν)大于2.1为阳性；PBST 含 3.2mM Na2HPO4,0.5mM KH2PO4,1.3mM KCl, 135mM NaCl,0.05%Tween20,pH7.4 ;抗原包被缓冲液为碳酸盐缓冲液(30mM碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液，pH9.6);抗体稀释缓冲液为 1%BSA, 0.0lM PBS ρΗ7.2。基于上述多克隆抗体的淮山药X病毒的Western blot检测方法。上述Western blot检测方法,包括以下步骤:(I)用TCA/丙酮沉淀法或采用植物蛋白质提取试剂盒提取淮山药总蛋白样品，用Bradford法进行蛋白质定量,调整蛋白质浓度为2mg/mL ；(2)制备蛋白电泳凝胶，进行SDS-PAGE ；(3)半干式转移:电泳结束后将凝胶割至合适大小，用转膜缓冲液平衡，5minX3次；预先裁好与凝胶同样大小的滤纸和PVDF膜，用甲醇浸泡Imin后，浸入转膜缓冲液中IOmin ;转膜装置从下至上依次按阳极碳板、3层3mm滤纸、PVDF膜、凝胶、3层3mm滤纸、阴极碳板的顺序放好，滤纸、凝胶、PVDF膜精确对齐，每一步去除气泡，盖好阴极碳板之后接通电源，恒流ImA/cm2,转移1.5h,转移结束后,断开电源将膜取出；(4)免疫反应:用0.0lM PBS洗膜，Imin ;加入封闭液,室温封闭I?2h ;弃封闭液，用0.0lM PBST洗膜，5minX3次；加入用抗体稀释缓冲液按照1:5000稀释的YVX的CP多克隆抗体(一抗)，室温孵育2h或4°C放置12h以上；阴性对照，以1%BSA取代一抗，其余步骤与实验组相同；弃一抗和1%BSA，用0.0lM PBST分别洗膜，5minX4次；加入用抗体稀释缓冲液稀释1000倍的碱性磷酸酶(AP)标记的羊抗兔IgG结合物(二抗)，平稳摇动，室温2h ；弃二抗，用0.0lM PBST洗膜，5minX4次；加入BCIP/NBT显色液，显色至出现条带时放入双蒸水中终止反应；转膜缓冲液为25m本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种淮山药X病毒的多克隆抗体制备方法，其特征在于：原核表达纯化淮山药X病毒的CP蛋白并用于免疫家兔制备多克隆抗体。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：陈保善，邹承武，蒙姣荣，
申请(专利权)人：广西大学，
类型：发明
国别省市：
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