用于制备LRRC52多克隆抗体的免疫原制造技术

本发明专利技术属于生物技术领域，涉及用于制备LRRC52多克隆抗体的免疫原，为多肽，其氨基酸序列为CQNNRIREVMDYTFI。本免疫原制备的LRRC52多克隆抗体具有效价高、特异性好的优点。其与小鼠或人精子孵育可显著抑制精子钾电流的产生，从而显著影响小鼠和人成熟精子的生理功能。该抗体既能作为研究精子生理调节机制的工具药，也可以作为开发新型男性避孕药的候选分子。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术属于生物
，涉及用于制备LRRC52多克隆抗体的免疫原，为多肽，其氨基酸序列为CQNNRIREVMDYTFI。本免疫原制备的LRRC52多克隆抗体具有效价高、特异性好的优点。其与小鼠或人精子孵育可显著抑制精子钾电流的产生，从而显著影响小鼠和人成熟精子的生理功能。该抗体既能作为研究精子生理调节机制的工具药，也可以作为开发新型男性避孕药的候选分子。【专利说明】用于制备LRRC52多克隆抗体的免疫原
本专利技术属于生物
，涉及用于制备LRRC52多克隆抗体的免疫原。
技术介绍
当前，生育问题已成为全球性重大社会卫生问题。据世界卫生组织公布的数据显 示，全球不育症患者人数已达0.8 ~ 1.1亿，并预测21世纪不育不孕将成为仅次于肿瘤和 心脑血管病的第三大疾病。中国目前约有15 %的配偶存在生育障碍，其中50 %的致病因 素与男性有关。另一方面，目前全球人口总量已达70亿总人口，且每年仍以7500万人口的 速度递增。与此同时，非意愿妊娠对人类健康和经济的损害亦不容忽视。因此，寻找理想 的避孕方式以主动控制人口数量具有重大的意义。然而，当前市场中避孕药主要是针对女 性生殖生理设计且大多为激素类药物，尚无市场化针对男性生殖生理的避孕药物。基于现 有女用避孕药的副作用以及人们生殖伦理观的改变，研发安全、有效、易恢复的男性避孕药 具有非常广阔的市场需求。由此可见，在分子水平揭示精子发育、成熟及功能调控的生理机 制，对于研究男性不育症的病理生理机制、探索其可能的治疗途径以及开发新型男性避孕 药物，均具有重要的社会意义。 哺乳动物精子在睾丸曲细精管内发生、发育后，尚须在离子浓度、渗透压和pH值 不断变化的微环境（附睾管和雌性生殖道)中进一步成熟并最终获得受精能力。离子通道等 膜蛋白是精子与局部微环境或卵子之间交流的工具，依靠膜上多样的膜蛋白（包括离子通 道)，精子不断调整、适应通向卵子过程中复杂、多变的微环境，最后实现受精这一复杂精细 的生命过程。大量研究表明，多种离子通道在精子运动、精子获能、顶体反应和精卵结合等 生理过程中扮演着重要角色，是调控精子功能的关键因子。 找寻具有调节控制精子功能的关键因子，进一步研究制备精子生理调节机制工具 药和制备男性避孕药具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种用于制备LRRC52多克隆抗体的免疫原，该免疫原制 备的多克隆抗体多克隆抗体具有效价高、特异性好的优点。该多克隆抗体与小鼠或人精子 孵育可显著抑制精子钾电流的产生，从而显著影响小鼠和人成熟精子的生理功能。该抗体 既能作为研究精子生理调节机制的工具药，也可以作为开发新型男性避孕药的候选分子。 本专利技术的技术方案如下： 用于制备 LRRC52 (LRRC52:Leucine-Rich-Repeating_Containing protein 52)多克 隆抗体的免疫原，为多肽，氨基酸序列为CQNNRIREVM DYTFI ; 所述的免疫原，还包括弗式完全佐剂等常规试剂； 本专利技术还涉及前述免疫原制备的LRRC52多克隆抗体； 所述的LRRC52多克隆抗体的制备方法，包括如下步骤：（1)合成目的多肽CQNNRIREVM DYTFI，将合成后的多肽溶于50%乙腈；（2)免疫原制备及首次动物免疫：取体重2 Kg以上 的新西兰兔为免疫动物，用400 μ I 0. OlM磷酸缓冲溶液溶解400 μ g上述合成多肽，与弗 式完全佐剂进行等比例混合，充分震荡乳化，将该乳剂作为免疫原在兔子背部行多点皮下 注射，注射20-40个点；（3)首次免疫3周后，将300 μ g合成多肽溶于300 μ 1 0. OlM磷 酸缓冲溶液溶解，与等体积弗式不完全佐剂充分乳化后作为免疫原进行背部皮内注射，作 为第一次免疫的加强免疫，注射15-25个点以上；（4)以后每3~ 4周加强免疫一次，方法 与要求同步骤（3); (5)注射免疫原后的7~10天耳动脉取血ELISA检测抗体效价，共免疫 4?5次，效价>10000可取血；常规方法收集纯化血清完成抗体制备； 为达到更好的技术效果： 步骤（1)乙腈为50%乙腈； 于步骤（5)取血采用心脏取血； 本专利技术还涉及所述LRRC52多克隆抗体在制备研究精子生理调节机制工具药和制备男 性避孕药中的应用。 本专利技术的有益效果如下：以氨基酸序列（CQNNRIREVM DYTFI)的多肽为抗原设计的 高效价、特异性LRRC52多克隆抗体能特异性识别LRRC52，经专利技术人大量研究发现LRRC52是 构成小鼠精子钾通道、介导精子钾电流的重要组分。LRRC52也可能是介导人精子KSper的 分子组分，并可能承担着与小鼠精子中类似的生理功能。LRRC52可作为开发调控精子功能 化合物和男性避孕药的新型分子靶点。而该多克隆抗体既能作为研究精子生理调节机制的 工具药，也可以作为开发新型男性避孕药用途。 【专利附图】【附图说明】 图I、LRRC52多克隆抗体纯度和质谱分析1。 图2、LRRC52多克隆抗体纯度和质谱分析2。 图3、LRRC52多克隆抗体纯度和质谱分析3。 图4、制备的LRRC52多克隆抗体与小鼠精子结合的特异性；Α.小鼠精子与LIDl 共孵育后出现明显的凝集现象（小鼠精子在添加正常小鼠 IgG (Al)或添加 LIDl (BI)液 体里孵育I h后，光学显微镜下观察不同视野精子的凝集现象。其中A2和B2分别对应Al 和Bl的蓝色方框区，放大倍数：X400; B. LIDl与小鼠精子蛋白结合的特异性。小鼠附睾 精子蛋白在不添加 （_)或添加 （+ ) PNGase F反应液中预处理后，利用制备的LIDl抗体（3 Pg/mL)行Western blot检测LRRC52蛋白的表达。箭头对应46 kD和33 kD条带)。 图5、制备的LRRC52多克隆抗体对小鼠精子生理功能的影响1 (在电极内液pH为 8. 0的条件下，给予小鼠精子从-100 mV到+100 mV渐变电压刺激，可记录到精子IKSper (A，B)，并观察加入不同浓度LIDl后IKSper的变化。曲线分别表示施加0、10 Pg/mL LID1、 50 Pg/mL LIDl和洗脱后。C为在_10(T+150 mV电压下，0或50 Pg/mL浓度LIDl作用于 小鼠精子IKSper的G-V曲线图，同时统计学分析LIDl对IKSper的抑制率，显示相邻两组 数据无显著差异（D)。n=5,电流值土SEM，t检验，*p〈0. 05有显著性差异。 图6、制备的LRRC52多克隆抗体对小鼠精子生理功能的影响2将小鼠精子与50 μ g/mL LIDl或50 μ g/mL小鼠 IgG共孵育，通过CASA记录分析精子的活率（A)、平均路径 速度（￥六？，8)、平均曲线速度（￥0^，〇、平均直线速度（￥51^，0)，*:?0.05，*邮0.01.配 对t检验，η =5)。 图7、制备的LRRC52多克隆抗体对小鼠精子生理功能的影响3 B与对照组相比， LIDl组诱发性AR率显著下降而自发性AR率无差异：p 0.05. t检验；η =5)。 图8、制备的L本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于制备LRRC52多克隆抗体的免疫原，其特征在于包括氨基酸序列为CQNNRIREVM DYTFI的多肽。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：曾旭辉，郑莉萍，罗韬，王涛，陈莹，王华锋，
申请(专利权)人：南昌大学，
类型：发明
国别省市：江西;36