【技术实现步骤摘要】
抗人肺炎链球菌fam1家族PspA蛋白抗体及应用该抗体的免疫层析试剂盒
本专利技术属于生物医学
,涉及抗人肺炎链球菌fam1家族PspA蛋白抗体及应用该抗体检测人肺炎链球菌的免疫层析试剂盒。
技术介绍
人肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae,Sp)是儿童呼吸道感染的重要病原体。主要经飞沫传播而进入呼吸道,从而寄生于人体的鼻咽部,或侵入人体不易清除的部位引起一系列的疾病,如大叶性肺炎,脑膜炎,支气管炎,中耳炎等。它是全球所有年龄组高发病率和病死率的主要病原菌。其中,在发展中国家,婴幼儿、老年人及免疫缺陷人群中尤为严重。肺炎链球菌于1881年首次由巴斯德(LouisPasteur)及G.M.Sternberg分别在法国及美国从患者痰液中分离出。其为革兰氏染色阳性,菌体似矛头状,成双或成短链状排列的双球菌,有毒株菌体外有化学成分为多糖的荚膜。其荚膜具有抗原性,是肺炎链球菌分型的依据。根据荚膜多糖抗原性的不同将肺炎球菌分为91个血清型。其菌体抗原主要为C多糖,其存在于肺炎链球菌细胞壁中,具有种特异性,为各型菌株所共有。C多糖可被血清中C-反应蛋白沉淀。在钙离子存在时,C多糖可与正常人血清中称为C-反应蛋白(Creactiveprotein,CRP)的β球蛋白结合,发生沉淀。目前针对人肺炎链球菌抗原的检测亦主要是针对此抗原,而该抗原非肺炎链球菌独有,如缓和链球菌亦含有该抗原。并且C多糖的提纯过程困难,造成生产成本较高。在肺炎链球菌表面还有一种与毒力相关的重要抗原,为肺炎链球菌表面蛋白A(PspA),其存在于所有肺炎链球菌血清型中,是肺炎链 ...
【技术保护点】
一种抗人肺炎链球菌fam1家族PspA蛋白抗体,其特征在于:所述抗人肺炎链球菌fam1家族PspA蛋白抗体是分别识别人肺炎链球菌fam1家族PspA蛋白71‑84位以及357‑370位氨基酸所组成的两个线性抗原表位的两种抗体,所述人肺炎链球菌 fam1家族PspA蛋白在GenBank序列号是AAF27703.1;所述人肺炎链球菌fam1家族 PspA蛋白71‑84位的14个氨基酸以及357‑370位的14氨基酸的氨基酸序列分别为KAAQKKYDEDQKKT及APKPEKPAEQPKAE;将人肺炎链球菌 fam1家族 PspA蛋白71‑84位的14个氨基酸以及357‑370位的14氨基酸的序列分别命名为P1及P2;所述抗人肺炎链球菌fam1家族PspA蛋白抗体是AbP1以及AbP2。
【技术特征摘要】
1.一种基于抗人肺炎链球菌fam1家族PspA蛋白抗体所形成的免疫层析试剂盒,其特征在于:所述试剂盒是基于量子点标记技术的免疫层析试剂盒或基于胶体金标记技术的免疫层析试剂盒;抗人肺炎链球菌fam1家族PspA蛋白抗体是AbP1以及AbP2,AbP1以及AbP2的制备方法是:1)经结构生物学分析及相关实验研究后,选定人肺炎链球菌fam1家族PspA蛋白71-84位的14个氨基酸及357-370位的14氨基酸组成的短肽分别作为制备兔抗人肺炎链球菌fam1家族PspA蛋白抗体的两个线性抗原表位,该两段氨基酸序列分别为KAAQKKYDEDQKKT及APKPEKPAEQPKAE,将此二序列分别命名为P1及P2;2)将步骤1)所述的氨基酸序列P1的C端、P2的N端分别添加一个半胱氨酸后,用多肽自动合成仪分别合成多肽并纯化,纯化后的两条多肽分别与载体蛋白KLH偶联,形成P1-KLH复合蛋白及P2-KLH复合蛋白;3)分别将步骤2)所合成的两种复合蛋白乳化,乳化后分别在兔腹部皮下多点注射,先后注射三次,每次间隔7-10天;4)第三次注射10-12天后,分别收集、分离得到两种含有兔抗人肺炎链球菌fam1家族PspA蛋白抗体的血清,ELISA分别检测血清中兔抗人肺炎链球菌fam1家族PspA蛋白抗体的效价,所述的两种兔抗人肺炎链球菌fam1家族PspA蛋白抗体的效价均在1:60000以上;5)将步骤2)合成并纯化的两条多肽分别与溴化氰活化的Sepharose4B偶联,形成两组多肽亲和层析柱;6)将步骤4)获得的两种含有兔抗人肺炎链球菌fam1家族PspA蛋白抗体的血清分别对应的加入到步骤5)制备的两种亲和层析柱中,并在4℃孵育过夜后,洗脱抗体,得到两种兔抗人肺炎链球菌fam1家族PspA蛋白抗体;经SDS-PAGE鉴定其纯度均在97%以上,将这两种纯化的抗体分别命名为AbP1及AbP2;所述试剂盒是基于量子点标记技术的免疫层析试剂盒时,所述试剂盒的制备方法是:1)量子点标记抗体AbP1溶液:向微量离心管中依次加入0.4nmol羧基水溶性量子点和800nmol碳二亚胺EDC,以MES缓冲液定容为1ml,混合溶液,37℃反应5min后,再加入0.4mg的制备得到的抗体AbP1,避光反应2h,加入单端氨基聚乙二醇PEG2000-NH2至终浓度为1%m/v,封闭未反应的活化羧基位点,继续避光反应1h;反应后的样品用超滤管离心,6500g离心5min,至体积200ul,将超滤后样品转移至普通EP管内,离心除团聚,得到上部清液以及下部沉淀,10000g条件下离心3min;将上部清液加到分离柱Superdex-200上纯化,待上部清液自然流入柱体中,然后用PBS冲洗,用紫外光照射柱体观察样品的位置,待样品开始从下部流出时开始收集,收集1ml后停止收集;将纯化后的样品用超滤管以6500g离心浓缩至200ul后转移至普通EP管内离心除团聚,对普通EP管进行离心的条件是10000g,3min;获取上清后以磷酸盐保存液稀释200倍,4℃保存备用;至此制得量子点标记抗体AbP1溶液;所述MES缓冲液中各组分含量分别是:10.66g/LMES以及0.74g/LEDTA,所述MES缓冲液的pH7.4;所述磷酸盐保存液的制备方式是称取0.29g磷酸氢二钠、0.0295g磷酸二氢钠、0.2g氯化钠、1g牛血清白蛋白BSA以及0.1gNaN3,溶解于90ml的去离子水中,用1mol/LNaOH调pH至7.3后用去离子水定容至100ml;2)制备结合垫将聚酯纤维膜浸入步骤1)所得到的量子点标记抗体AbP1溶液中1h,取出,25℃干燥后裁成后规格为4cm×0.6cm/条后,4℃密封保存备用,至此制得结合垫;3)制备样品垫取玻璃纤维素膜一张,将玻璃纤维素膜在样品垫处理液中浸泡至少3h,再置于生物安全柜内37℃通风干燥后,剪裁成规格为4cm×2.5cm/条后,即制得样品垫,25℃密封保存;所述样品垫处理液的制备方式是称取0.29g磷酸氢二钠、0.0295g磷酸二氢钠、0.2g氯化钠、2g牛血清白蛋白BSA、1ml吐温-20、2g蔗糖以及0.5g聚乙烯吡咯烷酮PVP-10,溶解于90ml的去离子水中,用1mol/LNaOH调pH至7.3后用去离子水定容至100ml;4)制备检测层将硝酸纤维素膜剪成4cm×4cm大小;将制备得到的抗体AbP2和羊抗兔IgG用磷酸盐缓冲液调整至终浓度分别为2.0mg/mL及1.0mg/mL;将稀释好的抗体AbP2装入BIODOT划膜仪喷头中,设置1.0μl/cm的量喷于硝酸纤维素膜上,形成检测线;将稀释好的抗兔IgG装入BIODOT划膜仪喷头中,设置1.0μl/cm的量喷于硝酸纤维素膜上作为质控线,质控线与检测线间距为0.7cm;将喷好的硝酸纤维素膜37℃干燥2h,剪裁成4cm×4cm的规格,4℃密封干燥保存;至此制得检测层;所述磷酸盐缓冲液的制备方式是:称取0.29g磷酸氢二钠、0.0295g磷酸二氢钠以及0.2g氯化钠,溶解于90ml的去离子水中,用1mol/LNaOH调pH至7...
【专利技术属性】
技术研发人员:胡征,董俊,杨波,
申请(专利权)人:湖北工业大学,湖北华龙生物制药有限公司,
类型:发明
国别省市:湖北;42
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