一种抗内氏放线菌卵黄抗体及其制备方法技术

本发明专利技术属于生物制品制备技术领域，具体涉及一种抗内氏放线菌卵黄抗体及其制备方法。抗内氏放线菌卵黄抗体的制备过程，具体包括：制备灭活的内氏放线菌作为抗原、免疫接种蛋鸡、分离纯化卵黄抗体等步骤。经过实际检验，本发明专利技术所制备的抗内氏放线菌卵黄抗体能显著抑制内氏放线菌的生长，并能有效清除内氏放线菌单菌生物膜的形成，并对其生物膜产酸有明显抑制作用，制备的抗内氏放线菌卵黄抗体对黏性放线菌具有一定的交叉免疫性。本发明专利技术具有容易制备、成本低廉等优点，将其添加到漱口液、牙膏、含片、奶制品、糕点、饮料、保健品等日常洗护用品或食品饮料时，对于内氏放线菌所引起的龋齿、牙龈炎、牙周炎的预防和治疗具有较好地应用效果。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物制品制备
，具体涉及一种抗内氏放线菌卵黄抗体及其制 备方法。
技术介绍
内氏放线菌（是口腔中定植的一种主要的放线菌，它通 过产生6-去氧太洛糖（6-deoxytalose)，将口腔中更多的放线菌和其他细菌黏附在牙釉质 上形成菌斑，菌斑中的细菌分解食物中的糖类产酸，酸化和腐蚀牙釉质形成龋齿，并可和其 他细菌进一步引起牙龈炎和牙周炎。 卵黄抗体（immunoglobulinyolk，IgY)是鸟类血液中的免疫球蛋白传递至卵 黄，并在卵孵育过程中和孵育后对幼鸟和幼禽起保护作用的免疫球蛋白，IgY的优势在于： 可与抗原特异性结合，发挥抗菌、抗病毒等多种生物学效应；制备经济简单，产量高；对实 验动物无伤害，满足动物权益保护的要求；稳定性好，具有耐热、耐酸、耐蛋白酶等诸多优 点。随着细菌耐药性的不断出现，应用卵黄抗体技术来发挥抗菌作用正逐渐成为研究热点。
技术实现思路
本专利技术主要目的在于提供一种抗内氏放线菌卵黄抗体，所提供的抗体用于漱口 液、牙膏、含片、奶制品、糕点、饮料、保健品等日常洗护用品或食品饮料时，可以对内氏放线 菌所引起的龋齿、牙龈炎、牙周炎等口腔疾病起到一定的预防和治疗作用。 本专利技术所采取的详细技术方案如下所述。 -种抗内氏放线菌卵黄抗体，通过以下步骤制备而成： (一） 制备灭活的内氏放线菌作为抗原，具体过程为，取内氏放线菌进行培养，获得菌 体，对菌体进行灭活处理，用生理盐水重悬菌体，调整菌液浓度为1X1〇7~1X10 ^CFU/mL 备用； 所述内氏放线菌采用血琼脂平板或用脑心浸液（brainheartinfusion，BHI)琼脂培 养基进行培养，培养条件为37°C、厌氧培养； 所述内氏放线菌具体采用例如美国模式培养物集存库（AmericanTypeCulture Collection)的保藏号为ATCC12104 的内氏放线菌（A.naeslundii); 所述内氏放线菌菌体灭活采用例如质量分数为〇. 2~0. 5%的甲醛进行灭活； (二） 免疫接种蛋鸡，具体过程为：取步骤(一）中所制备的灭活后的细菌悬液与佐剂按 1 :1体积比充分混合后，皮下和肌肉多位点免疫接种蛋鸡，每只鸡每次接种剂量为2~3 mL； 免疫接种完成后2周开始收集鸡蛋，所搜集鸡蛋均于4°C保存；可持续收集鸡蛋60天； 所用蛋鸡具体采用例如22周龄健康产蛋来杭母鸡（1600±230g); 所述免疫接种可具体接种4次，具体过程为：第一次免疫接种后两周进行第2次免疫接 种，以后每隔9~14天免疫接种一次；第一次免疫接种时使用弗氏完全佐剂，第二次、第三 次、第四次免疫接种所用佐剂为弗氏不完全佐剂； (三）分离纯化卵黄抗体，具体过程为： 首先取步骤（2)中所收集的鸡蛋，对鸡蛋外壳采用75%乙醇消毒清理后，打蛋分离蛋清 与卵黄，收集卵黄；对所收集的卵黄，按卵黄：双蒸水=1 :9的质量比加入无菌双蒸水，搅拌 充分混匀后，调节pH值至5. 0~5. 3,4°C静置过夜；然后4°C、10000~12000rpm离心20min， 收集上清液； 对所收集的上清液采用滴加（NH4) 2 304溶液方法获得卵黄抗体，具体过程为： 对所收集的上清液滴加饱和（NH4) 2S04溶液，使混合液中（NH4) 2 §04饱和度为50%， 4°C静置过夜；4 °C、10000rpm离心20~30min，弃上清，对沉淀物用蒸馏水溶解后，滴加 饱和（NH4) 2 304溶液使饱和度达33%，4°C静置过夜； 过夜后，4 °C、10000rpm离心20~30min，弃上清；对沉淀物（即采用滴加（NH4) 2 304溶液方法获得卵黄抗体）用蒸馏水溶解后，经100KD超滤膜超滤纯化，收集浓缩液，冷冻 干燥后即得到纯化的抗内氏放线菌卵黄抗体，所得抗体_80°C保存。 所述抗内氏放线菌卵黄抗体在口腔疾病预防与治疗中的应用，可对内氏放线菌、 黏性放线菌或其所形成的生物膜具有一定的预防和治疗作用，能够抑制生物膜的产酸；具 体而言， 抗内氏放线菌卵黄抗体对内氏放线菌的MIC为25Pg/mL，对黏性放线菌的MIC为20〇M<g/mL ; 抗内氏放线菌卵黄抗体对内氏放线菌的MBEC为50mg/mL，对黏性放线菌MBEC为80〇M<g/mL ; 为抑制生物膜内细菌产酸，针对内氏放线菌生物膜，抗内氏放线菌卵黄抗体浓度不小 于12. 5Pg/mL，针对黏性放线菌生物膜，抗内氏放线菌卵黄抗体浓度不小于200Pg/mL。 经过实际检验，本专利技术所制备的抗内氏放线菌卵黄抗体能显著抑制内氏放线菌的 生长，并能有效清除内氏放线菌单菌生物膜的形成，并对其生物膜产酸有明显抑制作用，制 备的抗内氏放线菌卵黄抗体对黏性放线菌具有一定的交叉免疫性。总体而言，本专利技术所提供的抗内氏放线菌卵黄抗体具有容易制备、成本低廉等优 点，将其添加到漱口液、牙膏、含片、奶制品、糕点、饮料、保健品等日常洗护用品或食品饮料 时，对于内氏放线菌所引起的龋齿、牙龈炎、牙周炎的预防和治疗具有较好地应用效果。【具体实施方式】 下面结合实施例对本专利技术做进一步的解释说明。 实施例1 本专利技术所提供的抗内氏放线菌卵黄抗体，其制备方法包括抗原制备、免疫注射产蛋母 鸡、收集鸡蛋分离纯化抗体等步骤，详细介绍如下。 (-）制备灭活的内氏放线菌作为抗原 具体过程如下： 取内氏放线菌进行培养，本实施例具体采用购买于美国模式培养物集存库（American TypeCultureCollection)的保藏号为ATCC12104 的内氏放线菌（A.naeslundii); 培养时采用血琼脂平板(也可采用脑心浸液（brainheartinfusion，BHI)琼脂培养 基）； 培养条件为：37 °C、厌氧培养4~6天； 培养结束后，在平板上加入适量无菌生理盐水，用涂布器刮下菌苔和菌落，然后吸入离 心管中，混匀； 将离心管5000~6000rpm、4°C，离心15~20min，弃上清，用0. 2~0. 5%甲酸(质量分 数）灭活18~24h，然后5000~6000rpm，4°C，离心15~20min，弃上清； 用生理盐水洗涤，具体过程为：在上述去除甲醛的离心管中加入生理盐水，混匀后， 5000~6000rpm、4°C、离心15~20min，弃上清；重复此过程不少于3次以确保完全将甲醛 洗去； 在上述生理盐水洗涤后的离心管中再次加入适量生理盐水，用麦氏比浊法测定并调整 细菌悬液浓度为1X1〇7~1X10tFU/mL备用。(二）免疫接种蛋鸡 取步骤(一）中所制备的灭活后的细菌悬液与佐剂按1 :1体积比充分混合后，皮下和肌 肉多位点免疫接种蛋鸡，每只鸡每次接种剂量为2~3mL; 本实施例中所用佐剂均为美国Sigma公司产品，所用蛋鸡为22周龄健康产蛋来杭母鸡 (1600±230g)，购自吉林农业大学养鸡场。 本实施例中免疫接种时共接种4次，具体过程为：第一次免疫接种后两周进行第2 次免疫接种，以后每隔9~14天免疫接种一次； 第一次免疫接种时使用弗氏完全佐剂，第二次、第三次、第四次免疫接种所用佐剂为弗 氏不完全佐剂。 本实施例中共免疫接种10只蛋鸡。4次免疫接种元成后2周开始收集鸡蛋，所搜 集鸡蛋均于4 °C保存；持续本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种抗内氏放线菌卵黄抗体的制备方法，其特征在于，具体包括以下步骤：（一）制备灭活的内氏放线菌作为抗原，具体过程为，取内氏放线菌进行培养，获得菌体，对菌体进行灭活处理，用生理盐水重悬菌体，调整菌液浓度为1×107～1×1010CFU/mL备用；（二）免疫接种蛋鸡，具体过程为：取步骤（一）中所制备的灭活后的细菌悬液与佐剂充分混合后，皮下和肌肉多位点免疫接种蛋鸡，每只鸡每次接种剂量为2～3 mL；免疫接种完成后2周开始收集鸡蛋，所收集鸡蛋均于4℃保存；（三）分离纯化卵黄抗体，具体过程为：取步骤（2）中所收集的鸡蛋，对鸡蛋外壳消毒清理后，打蛋收集卵黄，加入无菌双蒸水搅拌充分混匀后，调节pH值至5.0~5.3，4℃静置过夜；然后4℃、10000～12000rpm离心20min，收集上清液；对所收集的上清液采用滴加( NH4) 2 SO4溶液方法获得卵黄抗体；对所获得卵黄抗体用蒸馏水溶解后，经超滤纯化后，收集浓缩液，冷冻干燥后即得到纯化的抗内氏放线菌卵黄抗体。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：刘英杰，李瀚源，陈娟，刘云，
申请(专利权)人：河南大学，
类型：发明
国别省市：河南;41