【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物学，具体涉及一种人工毛囊种子细胞毛囊隆突区干细胞和毛乳头细胞分离方法及应用。
技术介绍
1、各种环境、疾病、心理、遗传等因素破坏了新生或者循环过程，带来的结果就是日益严重的脱发问题，严重影响当代人的生活质量。毛囊(hair follicle)作为最重要的皮肤附属物，由神经外胚层-中胚层相互作用形成的微小型器官，其发育与生长是具有周期性的动态循环过程。毛囊的形态发生与再生依赖于上皮与间充质的密切合作，也被称之为“上皮-间质互作”(epidermis-mesenchyme interaction，emi)。他是一个复杂的细胞-细胞通讯网络，通过旁分泌途径涉及wnt、hedgehog、notch和bmp等信号通路之间的强列相互作用。emi成为了手囊形态发生和再生的一个先决条件，已经成为毛囊组织再生的理论基础。
2、因此，再生毛囊的策略就是在体外模拟体内的emi，主要采取上皮和真皮细胞结合的方法，其中上皮细胞包括表皮干细胞、角质形成细胞等，真皮细胞包括毛乳头细胞、皮肤前体细胞。当然也存在使用诱导多能干细胞分化成毛囊。目前多选用新生来源或者胚胎来源细胞或者不同个体来源，如hasan erbil abaci等人(2018)使用新生来源的角质形成细胞与成体毛乳头细胞结合体外构建成人工毛囊。潜在的来源细胞仍然十分匮乏，无法满足广泛的需求。需要一种同一成体来源的大量种子细胞的获取方法解决这一问题。
3、在毛囊发育与新生的过程中，毛乳头和毛囊隆突区是毛囊永久存在的结构，在毛囊中的位置相对清晰。毛囊外根鞘中上
4、毛囊隆突区干细胞分离传统方法是基于流式细胞术(facs)的细胞分选细胞，trempus cs等(2003)和nowak ja等(2009)采取结合表面蛋白cd34和α6-整合素的识别可以大量富集隆突区干细胞。受设备和技术背景限制整个过程操作复杂，单细胞悬液在分离过程极易受到损伤，细胞活力变差，克隆形成低。随之发展出外迁法分离毛囊隆突区干细胞的方法，若采用细胞外迁的方法无论是毛囊隆突区干细胞还是真皮毛乳头细胞的分离都需要我们在毛囊单位的获取过程中尽可能做到保持结构的完整特别是隆突区和毛乳头。传统的毛囊单位获取方法多为单纯机械解剖法。如call m等人(2018)采取剪刀取下含有触须的唇垫。在解剖显微镜下，用镊子和剪刀去除皮下脂肪和结缔组织，以暴露触须，用细镊子将单个触须从垫上拔下。由于组织紧密、毛囊单位微小，使得操作难度增大也很难保证毛囊结构不被破坏。同样对于细胞分离培养来说也是借助于光学显微镜对分离得到的毛囊单位进行解剖，例如amoh y.等人(2005)将解剖的毛囊隆突区部位铺板在包被有鼠尾胶原的孔板以及段恩奎等(2010)将分离的毛囊贴壁培养分离干细胞却也都存在贴壁效果差分离时间长等问题。
5、另一方面对于毛乳头细胞采用是同样的外迁方法，最早是jahoda c等人1981年通过显微解剖的方法成功在体外分离和培养大鼠毛乳头细胞，不可避免带来很大的机械损伤，存在技术难度过高的问题，且巨大的工作量很难带来更好的效率。尽管做了解剖方法的优化，例如gledhill k等(2013)分离毛乳头的方案为切下毛囊的根端可见真皮鞘、被包裹的毛乳头以及部分发干，在显微镜下固定并对底部施加压力使得整个真皮鞘反转，毛乳头暴露，对暴露出来的毛乳头进行切割，然后收集培养。仍然是一个费事费力的大工程，也无法规避上述问题。与此同时为改良贴壁效率问题topouzi h等(2017)在铺板时用针尖划痕在培养皿底面，在一定程度上提高了贴附效率缩短培养时间。
6、因此一种可以同时稳定、高效分离和扩增毛囊隆突区干细胞和真皮毛乳头细胞的方法迫切需要。能在短时间内使用极少量的组织得到足够量的两种不同细胞，构建组合细胞团的共同培养，以便使用同一成体来源的模拟的毛囊类器官探究“上皮-间质互作”，解决在皮肤和毛囊的生物工程构建中的关键问题。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于解决人工毛囊种子来源的问题，提供一种人工毛囊种子细胞毛囊隆突区干细胞和毛乳头细胞分离方法及应用。本专利技术在分离时结合消化法和机械法，可以同时分离纯度高的毛囊隆突区干细胞和毛乳头细胞，组合培养得到模拟的毛囊类器官。
2、本专利技术的目的通过下述技术方案实现：
3、一种人工毛囊种子细胞毛囊隆突区干细胞和毛乳头细胞分离方法，包括如下步骤：
4、(1)啮齿动物面部触须垫部位消毒后将其解剖剥离、清洗后，用胶原酶ⅴ消化。
5、其中，所述的啮齿动物包括小鼠；所述的解剖剥离优选采用眼科剪进行；所述的消化的条件优选为用5mg/ml胶原酶ⅴ在37℃下消化30-60min。
6、(2)消化至组织松散膨大后终止消化，从真皮层一侧拔出保持完好的触须毛囊，切除毛乳头。
7、其中，所述的拔出毛囊优选采用镊子进行；所述的切除毛乳头优选在体视镜下采用外科手术刀进行。
8、(3)将步骤(2)所得毛囊清洗后移植到嵌入皿transwell膜上，使用分离培养基静置培养。
9、其中，所述的transwell膜上六孔板每孔优选移植8-12根毛囊；所述的培养的条件优选为37℃、5％ o2、5％ co2、90％ n2分压条件。
10、(4)将步骤(2)所得毛乳头用胶原酶ⅰ消化后清洗、分散、离心，使用分离培养基重悬得到悬液；悬液滴加于嵌入皿transwell膜上，使用分离培养基静置培养。
11、其中，所述的消化的条件优选为用2mg/ml胶原酶ⅰ在37℃下消化2h；所述的transwell膜上六孔板每孔优选6-8个毛乳头；所述的培养的条件优选为37℃、5％ co2条件。
12、(5)收取步骤(3)和(4)培养所得细胞，使用生长培养基进行传代培养，获得毛囊隆突区干细胞和毛乳头细胞。优选的，该步骤具体包括：步骤(3)中细胞密度达50％-70％第一次胰酶消化收获细胞，毛囊保留原位继续培养一周后，第二次胰酶消化收获细胞提高获得率；步骤(4)中细胞密度达80％胰酶消化收获细胞。使用生长培养基进行传代培养，获得毛囊隆突区干细胞和毛乳头细胞。其中，所述的胰酶优选为0.25％胰酶。所述的传代培养的条件优选为37℃本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种人工毛囊种子细胞毛囊隆突区干细胞和毛乳头细胞分离方法，其特征在于：包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的人工毛囊种子细胞毛囊隆突区干细胞和毛乳头细胞分离方法，其特征在于：步骤(2)中，所述的拔出毛囊的方法包括如下步骤：持一把镊子夹住毛干近端稳定毛囊，逆毛干生长方向推动以使真皮一侧毛囊暴露明显，用另一把镊子从真皮层一侧拔出单独的毛囊单位。
3.根据权利要求1所述的人工毛囊种子细胞毛囊隆突区干细胞和毛乳头细胞分离方法，其特征在于：
4.根据权利要求1所述的人工毛囊种子细胞毛囊隆突区干细胞和毛乳头细胞分离方法，其特征在于：
5.根据权利要求1所述的人工毛囊种子细胞毛囊隆突区干细胞和毛乳头细胞分离方法，其特征在于：步骤(1)、(3)、(4)中，所述的清洗使用的洗涤液为添加200units/mL青霉素、200mg/mL链霉素的PBS缓冲液。
6.根据权利要求1所述的人工毛囊种子细胞毛囊隆突区干细胞和毛乳头细胞分离方法，其特征在于：
7.权利要求1-6任一项所述的人工毛囊种子细胞毛囊隆突区干细胞和毛乳头细胞分离
8.一种制备毛囊类器官的方法，其特征在于：包括如下步骤：使用权利要求1-6任一项所述的方法获得毛乳头细胞、毛囊隆突区干细胞；毛乳头细胞通过体外三维培养形成球体细胞团后，更换含毛囊隆突区干细胞的培养基悬液，继续培养，获得由毛乳头细胞、毛囊隆突区干细胞构成的毛囊类器官。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：包括如下步骤：使用权利要求1-6任一项所述的方法获得毛乳头细胞、毛囊隆突区干细胞；将毛乳头细胞用生长培养基制成3000-5000个细胞/10μL的悬液，通过体外三维培养形成球体细胞团后，将培养液更换为用生长培养基制成含3000-5000个毛囊隆突区干细胞/10μL的悬液，继续培养，获得由毛乳头细胞、毛囊隆突区干细胞构成的毛囊类器官。
10.通过权利要求1-6任一项所述的方法获得的人工毛囊种子细胞毛囊隆突区干细胞、毛乳头细胞或通过权利要求8或9所述的方法获得的毛囊类器官在毛囊组织工程再生、体外毛发新生、毛发新生药物筛选中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种人工毛囊种子细胞毛囊隆突区干细胞和毛乳头细胞分离方法，其特征在于：包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的人工毛囊种子细胞毛囊隆突区干细胞和毛乳头细胞分离方法，其特征在于：步骤(2)中，所述的拔出毛囊的方法包括如下步骤：持一把镊子夹住毛干近端稳定毛囊，逆毛干生长方向推动以使真皮一侧毛囊暴露明显，用另一把镊子从真皮层一侧拔出单独的毛囊单位。
3.根据权利要求1所述的人工毛囊种子细胞毛囊隆突区干细胞和毛乳头细胞分离方法，其特征在于：
4.根据权利要求1所述的人工毛囊种子细胞毛囊隆突区干细胞和毛乳头细胞分离方法，其特征在于：
5.根据权利要求1所述的人工毛囊种子细胞毛囊隆突区干细胞和毛乳头细胞分离方法，其特征在于：步骤(1)、(3)、(4)中，所述的清洗使用的洗涤液为添加200units/ml青霉素、200mg/ml链霉素的pbs缓冲液。
6.根据权利要求1所述的人工毛囊种子细胞毛囊隆突区干细胞和毛乳头细胞分离方法，其特征在于：
7.权利要求1-6任一项所述的人工毛...
【专利技术属性】
技术研发人员：李涵泺，金启发，胡康洪，魏艳红，尧晨光，康思妮，刘剑，王雪，
申请(专利权)人：湖北工业大学，
类型：发明
国别省市：
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