一种GFP多克隆抗体的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种GFP蛋白多克隆抗体的制备方法，首先用DNAstar软件对GFP蛋白进行抗原预测分析，选择亲水性强，抗原性指数高的两段区域作为抗原区，然后通过设计引物，用含有GFP核苷酸序列的pCAMBIA1300质粒做模板，进行扩增；把抗原基因片段连接到pET28a载体上，重组质粒转化入BL21中，筛选阳性克隆并PCR鉴定；选用日本大耳白兔，在注射抗原的同时，加入免疫佐剂刺激机体产生较强的免疫反应，对多克隆抗体兔进行双肩皮下两点和双后腿肌肉两点常规免疫；纯化IgG抗体。本发明专利技术所制备的抗体具有效价高，灵敏性好，可重复等优点，可以有效弥补现有GFP抗体的缺点和不足；可以有效降低抗体的非特异性。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于抗体制备
，尤其涉及一种GFP多克隆抗体的制备方法。
技术介绍
绿色荧光蛋白(greenfIuorescentprotein，GFP)是由238个氨基酸组成的单体蛋白，1974年由Movie等首先从海洋生物水母中分离出来。GFP可作为一种报告基因，广泛用于蛋白质的定位、转运以及蛋白间互作、信号转导，病原检测，以及蛋白的分离与纯化等等方面。近年来，由于检测技术和仪器的发展，利用GFP融合蛋白，可以有效的分析蛋白数量、定位以及动力学特征。用GFP的荧光对蛋白进行有效分析的同时，由于融合了外源的GFP蛋白，也会存在其荧光容易淬灭、漂白和定位错误等一系列问题，因此制备高特异性与高灵敏度的GFP抗体，会提高GFP荧光的检测范围、灵敏度和准确度，是一种有效的补充手段，可以对荧光数据进行有效的辅助说明。另外，其他生物学过程如DNA结合、酶的活性，复合体的形成等需要如ChIP(chromatinimmunoprecipitation)和亲和纯化(affinitypurification)等实验方法，这些实验手段会受到抗体的特异性、灵敏度等影响，研究者往往通过对目的蛋白融合标签蛋白，来解决这个问题。通常所用到的标签蛋白如c-Myc、FLAG、GST等，奇怪的是，作为最为常用的标签GFP蛋白，虽然专利技术了其单抗与多抗，但生化分析中却很少被报道。这可能由于GFP抗体的效价与特异性低导致的结果，因此对于专利技术一种高效价、高灵敏性的GFP抗体就显得尤为重要。
技术实现思路
本专利技术实施例的目的在于提供一种GFP多克隆抗体的制备方法，旨在解决以往研究中的GFP抗体特异性不高、抗体效价低的问题。本专利技术所提供的GFP多克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：首先用DNAstar软件对GFP蛋白进行抗原预测分析，选择亲水性强，抗原性指数高的两段区域作为抗原区，然后通过设计引物，用含有GFP核苷酸序列的pCAMBIA1300质粒做模板，进行扩增；把抗原基因片段连接到pET28a载体上，重组质粒转化入BL21中，筛选阳性克隆并PCR鉴定；选用日本大耳白兔，一组二只，在注射抗原的同时，加入免疫佐剂刺激机体产生较强的免疫反应，对多克隆抗体兔进行双肩皮下两点和双后腿肌肉两点常规免疫；采用A蛋白或G蛋白纯化IgG抗体。进一步，模板质粒为：GFP双源表达载体。进一步，筛选阳性克隆并PCR鉴定具体方法如下：BL21菌液转接到1LLB培养基中，100r/min，37℃摇菌到OD值为0.8；然后加入IPTG至终浓度为20μmol/L，16℃摇菌过夜；离心收菌体后，按照每100mL菌液加4mLbindingbuffer，并加入Lysome至终浓度1mg/mL，室温摇床上摇至30min，4℃静置10min，进行超声波破碎，超声15s，间隔15s。进一步，从A蛋白和G蛋白柱上洗脱抗体时，需在4℃冷库进行，用proteinA/G对抗体进行纯化。本专利技术的另一目的在于提供一种所述多克隆抗体的制备方法在免疫组化的应用。本专利技术的另一目的在于提供一种所述多克隆抗体的制备方法在细胞学检测的应用。本专利技术首先对GFP蛋白全长的抗原性进行分析，选择两段高亲水性区段，构建融合蛋白，并进行原核表达；经过四次免疫后，经平行对照比较，所制备的抗体具有效价高，灵敏性好，可重复等优点，可以有效弥补现有GFP抗体的缺点和不足。本专利技术通过分析GFP蛋白全长的疏水与亲水结构域，然后选择高度亲水区的两个个区段作为抗原序列，进行蛋白表达，可以有效降低抗体的非特异性，选择两个个区段作为抗原，可以提高制备抗体的效价；所优化的实验体系，也适合于其他高效价、高灵敏度的蛋白抗体制备。附图说明图1是本专利技术实施例提供的GFP多克隆抗体的制备方法流程图。图2是本专利技术实施例提供的抗原区段的选择示意图。图3是本专利技术实施例提供的蛋白表达纯化示意图。图4是本专利技术实施例提供的抗体验证比对示意图。图5是本专利技术实施例提供的活体细胞标记示意图。图6是本专利技术实施例提供的免疫胶体金标记示意图。具体实施方式为了使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本专利技术进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。下面结合附图对本专利技术的应用原理作详细的描述。如图1所示，本专利技术实施例的GFP多克隆抗体的制备方法包括以下步骤：S101:首先用DNAstar软件对GFP蛋白进行抗原预测分析，选择亲水性强，抗原性指数高的两段区域作为抗原区，然后通过设计引物，用含有GFP核苷酸序列的pCAMBIA1300质粒做模板，进行扩增；S102:把抗原基因片段连接到pET28a载体上，重组质粒转化入BL21中，筛选阳性克隆并PCR鉴定；S103:选用日本大耳白兔，一组二只，在注射抗原的同时，加入免疫佐剂刺激机体产生较强的免疫反应，对多克隆抗体兔进行双肩皮下两点和双后腿肌肉两点常规免疫；S104:采用A蛋白或G蛋白纯化IgG抗体。下面结合附图2-图6对本专利技术的应用原理作进一步的说明：(1)抗原的选择首先用DNAstar软件对GFP蛋白进行抗原预测分析(如图2所示)，选择亲水性强，抗原性指数高的两段区域作为抗原区，然后通过设计引物，用含有GFP核苷酸序列的pCAMBIA1300质粒做模板，进行扩增；所用的模板质粒为：是一种常用的GFP双源表达载体；所述的DNAstar生物学软件为生物学常规软件，可以很方便的获得安装程序。(2)蛋白的纯化把设计好的抗原基因片段连接到pET28a载体上，其酶切位点与引物序列见表(1)，把重组质粒转化入BL21中，筛选阳性克隆并PCR鉴定。BL21菌液转接到1LLB培养基中，100r/min，37℃摇菌到OD值为0.8，然后加入IPTG至终浓度为20微摩/升，16℃摇菌过夜。离心收菌体后，按照每100mL菌液加4mLbindingbuffer，并加入Lysome至终浓度1mg/mL，室温摇床上摇至30min，4℃静置10min，进行超声波破碎，超声15s，间隔15s。所用的bindingbuffer和washingbuffer的配置均参考分子克隆第三版。表1片段一引物XbaIBamHI5'CCGGGCCATGGGATACCCAGATCATATGAA3'5'GGCCGGGATCCGTTTCCATCTT本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种多克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述多克隆抗体的制备方法包括以下步骤：首先用DNAstar软件对GFP蛋白进行抗原预测分析，选择亲水性强，抗原性指数高的两段区域作为抗原区，然后通过设计引物，用含有GFP核苷酸序列的pCAMBIA1300质粒做模板，进行扩增；把抗原基因片段连接到pET28a载体上，重组质粒转化入BL21中，筛选阳性克隆并PCR鉴定；选用日本大耳白兔，一组二只，在注射抗原的同时，加入免疫佐剂刺激机体产生较强的免疫反应，对多克隆抗体兔进行双肩皮下两点和双后腿肌肉两点常规免疫；采用A蛋白或G蛋白纯化IgG抗体。

【技术特征摘要】
1.一种多克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述多克隆抗体的制备方法
包括以下步骤：
首先用DNAstar软件对GFP蛋白进行抗原预测分析，选择亲水性强，抗原
性指数高的两段区域作为抗原区，然后通过设计引物，用含有GFP核苷酸序列
的pCAMBIA1300质粒做模板，进行扩增；
把抗原基因片段连接到pET28a载体上，重组质粒转化入BL21中，筛选阳
性克隆并PCR鉴定；
选用日本大耳白兔，一组二只，在注射抗原的同时，加入免疫佐剂刺激机
体产生较强的免疫反应，对多克隆抗体兔进行双肩皮下两点和双后腿肌肉两点
常规免疫；
采用A蛋白或G蛋白纯化IgG抗体。
2.如权利要求1所述的多克隆抗体的制备方法，其特征在于，模板质粒为：
GFP双源表达载体。
3.如权利要求1所述的多克隆抗体的制备方法，其特征...

【专利技术属性】
技术研发人员：肖建伟，李瑞丽，苏泊丹，林金星，
申请(专利权)人：北京林业大学，
类型：发明
国别省市：北京;11