本发明专利技术提供一种抗Bt Cry1Ab毒素单克隆抗体及其制备方法，即将保藏号为CCTCC NO:C201658的杂交瘤细胞株2C11接种于预先用石蜡油处理过的小鼠体内，以体内诱生法制备腹水，收集后以Protein G柱纯化腹水，即获得所述单克隆抗体；该抗体与Bt Cry1Ac毒素无交叉反应，可用于特异性检测Bt Cry1Ab毒素。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一株保藏号为CCTCCNO:C201658杂交瘤细胞2C11及其分泌的单克隆抗体与应用，特别是该单克隆抗体在BtCry1Ab毒素特异性检测中的应用，属于生物
技术介绍
Cry1Ab毒素是由苏云金芽胞杆菌(Bt)在孢子形成阶段产生的一种杀虫蛋白，对鳞翅目和鞘翅目类昆虫幼虫灭杀效果。其作用机理为：当Cry1Ab毒素被敏感昆虫幼虫摄取后，在碱性环境及中肠蛋白酶的作用下裂解为65KD大小的活性蛋白，并与肠道细胞中的特定的受体结合，导致孔隙的形成和中肠上皮细胞的裂解，最终导致幼虫死亡。另一方面，由于哺乳动物体内缺乏BtCry1Ab毒素蛋白的受体，所以BtCry1Ab毒素被认为对人类和家畜是无毒的。目前，BtCry1Ab毒素基因已被广泛引入转基因作物中,包含BtCry1Ab基因的转基因作物，如水稻、棉花、大豆和玉米等的种植面积在全球范围内逐年增加。转BtCry1Ab毒素基因抗虫作物的不断出现并得到大面积的推广，产生了极其显著的经济、社会和生态效益，但其对生态安全的风险以及对人类和其它哺乳类动物的安全隐患也逐渐受到关注。目前，转BtCry1Ab毒素基因的作物种类愈来愈多，带来的政府安全监管和食品加工企业原料管控的技术制约愈来愈明显，尤其是当针对一些转基因食物中基因检测不能取得满意效果的时候，对毒素表达产物安全筛查检测就显的尤为迫切。目前针对转基因产品中毒素蛋白的检测方法主要是集中在核酸和蛋白质分析领域，基于DNA-PCR的技术的检测方法由于具有高度的敏感性，成为目前使用最为广泛的Bt基因检测技术，然而，PCR方法需要由经验丰富的实验人员操作特定的仪器，不仅耗时而且不适用于现场快速检测。另一方面，基于蛋白质的检测方法，酶联免疫吸附测定试验(ELISA)克服了前者的缺点，具有特异性强、灵敏度高、样品前处理简单、成本低、适用于现场批量检测等优点，已应用于食品、医疗等多个领域。免疫分析是利用抗原和抗体的特异性结合反应和抗原、抗体上的标记物的生物、物理或活性放大作用来对超微量残留物进行定性、定量检测，而抗体的特异性、灵敏度等直接影响检测结果，由于BtCry1Ab和BtCry1Ac毒素蛋白非常相似，现有技术制备的单克隆抗体无法将二者两个区分开（U.Walschus,S.Witt,C.Wittmann,DevelopmentofmonoclonalantibodiesagainstCry1AbproteinfromBacillusthuringiensisandtheirapplicationinanELISAfordetectionoftransgenicBt-maize,FoodAgric.Immunol.14(2002)231-240.），目前市场上使用的BtCry1AbELISA检测试剂盒实际上是BtCry1Ab/Cry1Ac检测试剂盒，因此提供一种BtCry1Ab毒素特异性检测抗体，实现对BtCry1Ab毒素特异性ELISA检测，已成为本领域亟待解决的技术难题。
技术实现思路
针对上述问题，本专利技术提供一株保藏号为CCTCCNO:C201658杂交瘤细胞2C11，其分泌的单克隆抗体可针对BtCry1Ab毒素进行特异性检测，特异性强，操作步骤简单，本发明是这样实现的：一种抗BtCry1Ab毒素单克隆抗体，其是由保藏号为CCTCCC201658的杂交瘤细胞分泌产生的；其轻链可变区具有序列表SEQIDNO.1所示的氨基酸序列；重链可变区具有序列表中SEQIDNO.2所示的氨基酸序列，该单克隆抗体可特异性识别BtCry1Ab毒素，且与BtCry1Ac毒素无交叉反应活性。进一步，本专利技术所述的抗BtCry1Ab毒素单克隆抗体，制备方法如下：将保藏号为CCTCCC201658的杂交瘤细胞接种于预先用石蜡油处理过的小鼠体内，以体内诱生法制备腹水，收集后以ProteinG柱纯化腹水，即获得浓度为0.6mg/mL的抗BtCry1Ab毒素单克隆抗体。进一步，如本专利技术所述的抗BtCry1Ab毒素单克隆抗体在检测BtCry1Ab毒素中的应用。进一步，本专利技术还提供一株杂交瘤细胞株2C11，保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏号为CCTCCNO:C201658，保藏时间为2016年3月22日。本专利技术根据BtCry1Ab和BtCry1Ac毒素蛋白三维结构上的差异，设计了一种特异性抗原多肽，将其与载体蛋白KLH偶联后，免疫BALB/c小鼠，成功获得了针对BtCry1Ab毒素检测用的特异性单克隆抗体，其保藏号为CCTCCNO:C201658；实验表明，浓度为0.6mg/mL的该抗体稀释128000倍后，对BtCry1Ab毒素的OD450值仍然高于1.0，具有较高效价，该抗体与BtCry1Ac毒素无交叉反应，可用于特异性检测BtCry1Ab毒素。附图说明图1为选定肽段的抗原性和亲水性分析结果示意图；图2为BtCry1Ab，Cry1Ac及选定肽段的三维结构模型示意图；图3为单克隆抗体2C11间接ELISA检测结果示意图。图4为BtCry1Ab毒素双抗夹心ELISA标准曲线图5为金标垫结构示意图。图6为金标垫检测结果示意图。具体实施方式实施例中涉及溶液的制备方法：（1）磷酸盐缓冲液（PBS，pH7.4）：NaCl8.0g，KCl0.2g，Na2HPO4·12H2O2.9g，KH2PO40.2g，加蒸馏水定容至1L；（2）洗涤液（PBST）：含有0.05%Tween-20的PBS；（3）封闭液（MPBS）：含有3%脱脂奶粉的PBS；（4）柠檬酸盐缓冲液（CPBS，底物缓冲液，pH5.5）：C6H7O8（柠檬酸）21g，Na2HPO4·12H2O71.6g，加蒸馏水定容至1L；（5）底物：10mg/mL的TMB和25μL0.65%H2O2溶于9.875mLCPBS中，现配现用；（6）四甲基联苯胺（TMB）母液：称取10mg四甲基联苯胺溶于1mL二甲基亚砜，4℃保存；（7）终止液（2MH2SO4）：取11.8mL98%的浓硫酸（18M）溶于80mL蒸馏水，冷却后定容到100mL；（8）碳酸盐缓冲液（CBS）：Na2CO31.59g；NaHCO32.93g，定容到1L；实施例中所涉及的试剂：弗式完全佐剂和弗式不完全佐剂均购于Sigma公司；BtCry1Ab和BtCry1Ac标准毒素购自上海佑隆生物科技有限公司；实施例中所涉及的氨基酸序列：SEQIDNO.1:DIVLTQSPASLAVSLGQRATISYRAS本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种抗Bt Cry1Ab毒素单克隆抗体，其是由保藏号为CCTCC NO: C201658的杂交瘤细胞株2C11分泌产生的。
【技术特征摘要】
1.一种抗BtCry1Ab毒素单克隆抗体，其是由保藏号为CCTCCNO:C201658的杂交瘤细
胞株2C11分泌产生的。
2.根据权利要求1所述的抗BtCry1Ab毒素单克隆抗体，其特征在于，制备方法如下：将
保藏号为CCTCCNO:C201658的杂交瘤细胞株2C11接种于预先用石蜡油处理过的小鼠体<...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘贤金，董飒，刘媛，张霄，胡静，
申请(专利权)人：江苏省农业科学院，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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