本发明专利技术属于生物技术领域，涉及一种基于单域重链抗体的免疫亲和吸附材料，特别是针对黄曲霉毒素的免疫亲和吸附材料。包括载体，搭载在载体上的配基，其特征在于该材料以特异性识别黄曲霉毒素的单域重链抗体作为配基，所述特异性识别黄曲霉毒素的单域重链抗体具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。该抗体具有耐酸碱、耐高温以及易于生产等特性，对于黄曲霉毒素的低成本、可重复使用的免疫学检测方法有重要的实用价值。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种基于单域重链抗体（又称纳米抗体技术）的免疫亲和吸附材料， 特别是针对黄曲霉毒素的免疫亲和吸附材料。 技术背景 黄曲霉毒素是一类主要由黄曲霉菌、寄生曲霉菌等真菌产生的剧毒次级代谢 产物。它们的化学结构类似，为二呋喃香豆素衍生物，主要包括黄曲霉毒素^仏?81)、 B2(AFB2) 々(AFGi)、G2(AFGi)等。在天然污染的食品和饲料中，AFBi的污染最为常 见，其毒性和致癌性也最强，被世界卫生组织的癌症研究机构划定为I类致癌物。世界各国 及地区指定了严格的黄曲霉毒素限量标准，例如欧盟婴幼儿食品中AFBi允许量<0. 10 μ g/ kg 〇 现有的黄曲霉毒素检测方法主要有仪器分析法、免疫分析法以及薄层层析法。其 中仪器分析法具有灵敏度高、准确性和重复性好等优点，但是对于分析样品前处理要求较 高，需要尽量去除样品中的杂质以减少对后续检测的干扰。传统的前处理方法有液相萃取、 固相萃取等，处理过程繁琐且特异性不高。亲和层析技术基于配基与待测物质之间特异性 的识别，可通过一步操作实现对复杂混合样品中待测物的分离纯化。目前使用的黄曲霉毒 素亲和纯化介质一般采用多克隆抗体或单克隆抗体作为配基，存在不耐有机试剂、活性迅 速降低的问题。因此，需要开发活性高、稳定性好的新型配基替换传统抗体。单域重链抗体 是由羊驼重链抗体的可变区组成，又称为纳米抗体，具有耐酸碱、耐高温以及易于生产等特 性，相较于传统抗体具有明显的优势。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种针对黄曲霉毒素的免疫亲和吸附材料及其应用。 为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案： 针对黄曲霉毒素的免疫亲和吸附材料包括载体和配基，所述配基为单域重链抗 体，具有SEQ ID Ν0. :1所示的氨基酸序列。该配基可特异性识别黄曲霉毒素。 所述配基还可以为在前述单域重链抗体基础上通过随机或定点突变技术进行改 造所获得的能与黄曲霉毒素特异性结合的抗体。 所述载体为磁珠、琼脂糖凝胶微球、硅胶微球或多孔材料。 上述黄曲霉毒素免疫亲和吸附材料的制备方法，其特征为： 所述载体为磁珠时，制备方法为：取lmg羧基磁珠于离心管中，加入500~ 1000 μ 1活化缓冲液（10mM，NaH2P04, pH6. 0)，涡旋混合均匀，磁力架回收磁珠，再用活化缓 冲液洗涤2遍。分别加入1~5mg碳二亚胺（EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS)，涡旋混合 后，静置30min。用偶联缓冲液（10mM，Na2HP04, pH 7. 4)洗涤磁珠3遍，加入抗黄曲霉毒素 单域重链抗体，室温反应2~6h，得到共价偶联了抗黄曲霉毒素单域重链抗体的免疫磁珠； 所述载体为琼脂糖凝胶微球时，制备方法为：将CNBr活化的干胶用0. 1M HC1洗涤 10~15次，每次平衡5~lOmin。用偶联缓冲液（10mM，Na2HP04, pH 7. 4)洗涤5~15次， 加入抗黄曲霉毒素单域重链抗体，室温反应2~10h，得到共价偶联了抗黄曲霉毒素单域重 链抗体的免疫亲和吸附材料； 所述载体为硅胶微球时，制备方法为：将硅胶微球用纯水和磷酸缓冲液（PBS， 10mM，pH 6. 0)交替洗涤5~10次，用PBS缓冲液悬浮硅胶微球，加入抗黄曲霉毒素单域 重链抗体，混勾，加入终浓度1~l〇mg/ml的碳二亚胺（EDC)，迅速混勾，4°C搅拌反应12~ 24h，得到共价偶联了抗黄曲霉毒素单域重链抗体的免疫亲和吸附材料。 将上述免疫亲和吸附材料（载体为琼脂糖凝胶微球和硅胶微球）装填至层析柱， 即得到黄曲霉毒素免疫亲和层析柱，方法为：根据层析柱容量，取适量上述免疫亲和吸附材 料于层析柱，加入5~10倍柱床体积的PBS (10mM，pH 7. 4)洗涤后，4°C，保存于20%乙醇 溶液。 共价偶联了抗黄曲霉毒素单域重链抗体的免疫磁珠无需装柱，直接吸附后磁铁分 离。 本专利技术还涉及装载有所述黄曲霉毒素免疫亲和吸附材料的亲和层析柱。 上述黄曲霉毒素免疫亲和吸附材料的应用，用所述黄曲霉毒素免疫亲和吸附材料 对样品提取液进行净化，富集黄曲霉毒素 （AFBp AFB2、AFGiS AFG 2)。黄曲霉毒素免疫亲和 吸附材料在去除黄曲霉毒素、净化黄曲霉毒素污染物料中的应用。这种处理不以疾病诊断 治疗为目的。当免疫吸附材料的载体为琼脂糖凝胶微球和硅胶微球时，方法为：首先用纯水 清洗免疫吸附材料，加入样品提取液，然后用纯水淋洗，再用甲醇洗脱特异性吸附的黄曲霉 毒素，收集的洗脱液，即为净化和富集后的样品提取液，可用于后续分析检测。当载体为磁 珠时，方法为：将免疫磁珠加入纯水中，磁力架回收磁珠，重复清洗3~5次，然后将免疫磁 珠加入样品提取液中，混匀，磁力架回收磁珠，纯水清洗1~3次后，甲醇洗脱特异性吸附的 黄曲霉毒素，收集的洗脱液，即为净化和富集后的样品提取液，可用于后续分析检测。 本专利技术针对黄曲霉毒素的免疫亲和吸附材料配基为单域重链抗体，具有SEQ ID NO. :1所示的氨基酸序列，该配基可特异性识别黄曲霉毒素。该单域重链抗体容易获得，可 以通过生物学方法大量培养生产配基为单域重链抗体，避免了人工抗体等繁琐生产方法， 大大降低了生产成本。生产过程无需接触黄曲霉毒素，避免了对生产人员身体伤害。具有 耐酸碱、耐高温以及易于生产等特性，这些特性对于黄曲霉毒素的低成本、可重复使用的免 疫学检测方法有重要的实用价值。【具体实施方式】 下面通过黄曲霉毒素免疫亲和吸附材料的制备及应用，对本专利技术做进一步说明， 这些具体实施例不应以任何方式被解释为限制本专利技术的应用范围。 实施例1 : 抗黄曲霉毒素单域重链抗体（即针对黄曲霉毒素的单域重链抗体）免疫文库的构 建 将黄曲霉毒素队与匙孔血蓝蛋白（keyhole limpet hemocyanin，KLH)共价偶联， 得到黄曲霉毒素人工抗原AFBfKLH，取300 μ g AFBfKLH与弗氏完全佐剂乳化后，对羊驼 (Lama pacos)进行皮下多点注射免疫。加强免疫采用150 μ g AFBfKLH与弗氏不完全佐剂 乳化，间隔2周进行，每次免疫7天后静脉取血，采用间接ELISA法测定血清效价，选择血清 效价最高的样品分离淋巴细胞，提取RNA。 RNA的提取参照TAKARA公司RNAiso试剂说明书进行。以RNA为模板，oligo dT 为引物，参照TAKARA公司反转录酶说明书合成cDNA第一链。 采用PrimeSTAR高保真DNA聚合酶，经巢式PCR获得重链抗体的可变区编码基因 (采用的引物见表1)。第一轮PCR分别以引物AlpVh-LD和CH2-R扩增cDNA，反应条件为， 98Γ，10s，55Γ，20s，72Γ，lmin，20 个循环，98Γ，10s，68Γ，lmin，72Γ延伸 lOmin。 将第一轮PCR产物用1. 2 %的琼脂糖凝胶电泳，回收600bp~750bp的DNA片 段，作为第二轮PCR的模板，分别用引物AlpVh-Sfil和AlpVHHRl-Notl，AlpVh-Sfil和 八1口￥冊1?2-如《，进行扩增，反应条件为，98°(：，1〇8,50°(：，2〇8,72°(：，4〇8,5个循环，98°(：， 108,68°(：，408,30个循环，72°(：延本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种黄曲霉毒素免疫亲和吸附材料，包括载体，搭载在载体上的配基，其特征在于该材料以特异性识别黄曲霉毒素的单域重链抗体作为配基，所述特异性识别黄曲霉毒素的单域重链抗体具有SEQ ID NO.:1所示的氨基酸序列。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：涂追，许杨，熊勇华，李燕萍，黄志兵，
申请(专利权)人：南昌大学，
类型：发明
国别省市：江西;36
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