基于碱基编辑靶向LewisY的CAR-T细胞及其制备方法和应用技术

本发明专利技术属于免疫治疗领域，公开了一种PD‑1基因敲除且靶向Lewis Y的CAR‑T细胞，并公开了通过BE‑Plus系统进行基因敲除的同时将表达LewisY‑CAR的质粒载体导入T细胞的制备方法，以及该CAR‑T细胞在制备抗肿瘤药物中的应用。本发明专利技术公开的PD‑1基因敲除且靶向Lewis Y的CAR‑T细胞可以解除PD‑1/PD‑L1的抑制通路，有助于改良靶向LewisY的CAR‑T细胞的功效，且制备工艺简单，在肿瘤的细胞治疗中拥有较高的应用价值。

CAR-T cells targeting LewisY based on base editing and their preparation methods and Applications

The present invention belongs to the field of immunotherapy, and discloses a kind of AR_T cell with PD_1 gene knockout and targeting Lewis Y. It also discloses the preparation method of introducing a plasmid vector expressing Lewis Y_CAR into T cells while gene knockout is carried out by BE_Plus system, and the application of the CAR_T cell in the preparation of anti-cancer drugs. The AR T cells targeting Lewis Y can remove the inhibition pathway of PD 1/PD L 1, help to improve the efficacy of AR T cells targeting Lewis Y, have simple preparation process and high application value in cancer cell therapy.

【技术实现步骤摘要】
基于碱基编辑靶向LewisY的CAR-T细胞及其制备方法和应用
本专利技术涉及免疫学领域，具体涉及免疫治疗领域，尤其涉及一种PD-1基因敲除且表达LewisY-CAR的T细胞及其制备方法和其应用。
技术介绍
肿瘤免疫治疗是通过重新启动并维持肿瘤-免疫循环，恢复机体正常的抗肿瘤免疫反应，从而控制与清除肿瘤的一种治疗方法。由于其卓越的疗效和创新型，在2013年被《科学》杂志评为年度最重要的科学突破。近年来肿瘤的免疫疗法已经成为当前肿瘤治疗的热点。其中嵌合抗原受体T细胞技术（CheimeticAntigenReceptors-Tcell，CAR-T）是一种新型的过继性细胞疗法（Adoptivecelltransfertherapy，ACT），该疗法将患者的T细胞在体外修饰增殖后回输到患者体内，通过T细胞表达的特异性受体，靶向性的识别肿瘤细胞，且CAR-T细胞在体内能显示出较强的杀伤活性和持久性。LewisY抗原是结合Ⅱ型血型寡糖链的四糖结构，LewisY抗原主要表达于胚胎发生期，在成人其表面表达则限于粒细胞和上皮表面。研究发现：在70-90%的上皮组织的癌细胞中发现了LewisY的过表达。LewisY作为靶结构的优点为表达抗LewisY嵌合受体的T细胞可能潜在的靶向表达LewisY的广泛恶性肿瘤。有研究表明以LewisY为靶点的LewisY-CAR转导的T细胞对RPMI8226-13细胞和原代MM细胞表现出特异性的增殖杀伤活性。SPeinert（‎2010）的研究进一步证实了表达抗LewisY嵌合受体的T细胞在体外的特异性和其体内抗肿瘤活性，展现出CAR-T细胞靶向治疗肿瘤的另一个前景。CAR-T细胞的组成包括抗原结合区、跨膜铰链区和胞内信号区三个部分。胞外区主要是单克隆抗体的单链可变区序列（scFv），可识别肿瘤特异性抗原；胞内区主要是T细胞受体CD3的ζ链或者是免疫球蛋白Fc受体的γ链（FcRγ），向细胞内转导胞外识别的信号。一般通过电穿孔或病毒转导，使嵌合抗原受体分子表达在T细胞表面形成CAR-T细胞，使其可以特异性识别和结合肿瘤细胞表面的抗原并裂解肿瘤细胞。虽然CAR-T细胞在血液恶性肿瘤中显示出了很好的疗效，但是在实体瘤方向的应用仍然存在比较大的局限性，比如缺乏肿瘤特异性抗原，或者难以到达肿瘤部位，以及易受肿瘤微环境影响丧失功能或活性。肿瘤微环境的免疫逃逸机制主要是通过PD-1/PD-L1抑制通路，导致T细胞不能杀伤肿瘤细胞。通过靶向敲除PD-1基因，可以解除PD-1/PD-L1的抑制通路，有助于改良靶向LewisY的CAR-T细胞的功效。此外，将CAR-T细胞进行PD-1基因敲除，使其免受肿瘤微环境的抑制，可能提高靶向杀伤能力。中国专利CN201410077474.6提供了一种快速、简便、高效、特异性靶向敲除基因，通过提供精准特异性靶向PD-1基因的sgRNA，利用CRISPR-Cas9技术，达到特异性敲除PD-1基因的目的。但是，CRISPR-Cas9介导的基因编辑存在严重的脱靶效应，使其在临床应用上存在一定的安全隐患。为了解决CRISPR-Cas9所显示出的缺陷和局限性，本专利技术提供一种更加精确特异性更强的针对T细胞PD-1基因敲除的方法及其应用，并提供相应的技术方案，达到制备目的免疫细胞PD-1基因敲除且表达LewisY-CAR的T细胞的技术方案。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题之一是提供PD-1基因敲除且表达LewisY-CAR的T细胞，该CAR-T细胞能够免受肿瘤微环境的抑制，特别是PD-1通路介导的免疫抑制，且具有超越一般靶向LewisY的CAR-T细胞的杀伤能力。本专利技术要解决的技术问题之二在于提供一种PD-1基因敲除且表达LewisY-CAR的T细胞的制备方法，并提供相应的技术方案，该制备工艺简单，编辑效率高。本专利技术要解决的技术问题之三在于提供PD-1基因敲除且表达LewisY-CAR的T细胞在制备抗肿瘤的细胞治疗药物中的应用。为解决以上问题，本专利技术采用如下技术方案：为了提高基因编辑效率以实现在体基因编辑，本专利技术采用基于CRISPR/Cas9技术的单碱基编辑器（baseeditor,BE）。BE-PlUS系统优势在于，第一，与CRISPR-Cas9相比，BE-PLUS具有更高的编辑效率，较低的插入突变率以及更低的脱靶率；第二，与Cas9核酸酶介导的基因编辑相比，BEs可以高效修改点突变基因，是在体基因编辑的良好工具。BE-Plus双质粒系统（scfv-APOBEC-UGI，GCN4-D10A），在D10A的N端接10个GCN4，APOBECN端接一个scFv。这样GCN4-D10A可以招募10个scFv-APOBEC，使突变的机率增大。Workwindow由4-8扩为4-16，使效率更高。BE-Plus双质粒系统基本原理为，BEPlus系统携带大鼠胞嘧啶脱氨酶APOBEC1的Cas9，可将胞嘧啶（C）转变为尿嘧啶（U），尿嘧啶DNA糖基酶抑制剂UDI抑制碱基切除修复机制，使UG配对得以保留，并在后续复制过程中，U替换成T，突变产物理论上可达50%。再通过dCas9和MMR机制，以UG中的U为模板，将UG替换修复成UA，后续复制变为TA，产率在15%~75%之间。使用的基因敲除方法为Istop，为在基因编码区内，将正常氨基酸密码子突变为终止密码子，使翻译过程提前终止。对CAR-T细胞进行PD-1基因的定点突变，使其免受肿瘤微环境的抑制，可能提高靶向杀伤能力。本专利技术采用来源于鳞翅目昆虫的PiggyBac转座子，在哺乳动物宿主中活性较高，而且携带片段较大。另外，采用的质粒系统，制备工艺相对简单，通过转座酶将外源基因整合入基因组，操作简单而且整合效率相对较高。本专利技术的第一方面，提供PD-1基因敲除且表达LewisY-CAR的T细胞。作为本专利技术优选的技术方案，所述PD-1基因敲除且表达LewisY-CAR的T细胞，采用的基因敲除方法是通过BE-Plus系统或Cas9、ZFN、TALEN基因敲除方法来实现。作为本专利技术优选的技术方案，所述的基因敲除方法是通过BE-Plus系统来实现，BE-Plus系统中PD1-sgRNA寡核苷酸的设计和构建，具体步骤为：①明确待PD-1基因的编码区（CDs）20bp-NGG目标序列（PAM序列），使其包含完整的目标密码子CAA、CAG、CGA；②目标单碱基C位于目标序列的（左端）第1-16位，效率不一样，优选为第4-16位；并且目标密码子的上游紧邻碱基最好不能为G；③目标单碱基T位于目标序列的（左端）第1-16位，效率不一样，优选为第4-16位；并且目标密码子的上游紧邻碱基最好不能为G；④按照选定的特异性靶序列，分别合成正向具有5’-N20-NGG-3’特征的寡核苷酸链及与其互补的反向寡核苷酸链，通过退火获得互补寡核苷酸双链片段；⑤对pGL3-U6-sgRNA质粒进行线性化，并向反应体系中加入BsaⅠ内切酶进行酶切反应；⑥将步骤④和⑤中所获得双链sgRNA寡核苷酸与线性化的pGL3-U6-sgRNA质粒进行混合，并向体系中加入T4DNA连接酶，进行连接；⑦将步骤⑥中所获得的连接产物转化DH5α感受态细胞并涂Amp+平板（50μg/ml）,并挑取克隆测序本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种PD‑1基因被敲除的CAR‑T细胞，其特征在于，PD‑1基因敲除且表达LewisY‑CAR的T细胞，采用的基因敲除是通过BE‑Plus系统或Cas9、ZFN、TALEN基因敲除方法来实现。

【技术特征摘要】
1.一种PD-1基因被敲除的CAR-T细胞，其特征在于，PD-1基因敲除且表达LewisY-CAR的T细胞，采用的基因敲除是通过BE-Plus系统或Cas9、ZFN、TALEN基因敲除方法来实现。2.如权利要求1所述的CAR-T细胞，其特征在于，所述的基因敲除通过BE-Plus系统来实现，具体为：选定基因敲除的位点，设计靶点序列sgRNA，随后筛选出靶点序列，具体如下所示：sgRNA1-F：如SEQIDNO.2所示；sgRNA1-R：如SEQIDNO.3所示；sgRNA2-F：如SEQIDNO.4所示；sgRNA2-R：如SEQIDNO.5所示；sgRNA3-F：如SEQIDNO.6所示；sgRNA3-R：如SEQIDNO.7所示；所述靶点序列可用于质粒载体上，慢病毒载体上，或用于逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体或其他类型的载体上。3.如权利要求2所述的CAR-T细胞，其特征在于，所述选出的靶点序列为如下序列：sgRNA1-F：如SEQIDNO.2所示；sgRNA1-R：如SEQIDNO.3所示。4.如权利要求1-3任一项所述的LewisY-CAR包含LewisY-scFv，LewisY-scFv用于识别LewisY抗原，该LewisY-scFv序列为如SEQIDNO.1所示。5.如权利要求4所述的PD-1基因被敲除的表达LewisY-CAR的T细胞的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）从供者提供的外周血中分离PBMC；（2）在转染体系中，将表达LewisY-CAR的质粒、转座酶质粒、BEPlus双质粒、靶向PD-1的sgRNA质粒共同转染步骤（1）PBMC细胞，获得转染后的细胞，并进行体外培养、大量扩增；（3）用CD3抗体刺激步骤（2）得到的细胞，以获得PD-1基因敲除且表达LewisY-CAR的T细胞，并对所获得T细胞进行后续...

【专利技术属性】
技术研发人员：王丹，尚小云，徐凡丽，蒋海娟，赵丹，辛雨，
申请(专利权)人：苏州茂行生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32