稳定高效表达HCV NS3蛋白抗体的工程细胞株及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一对稳定高效表达HCV NS3蛋白抗体的工程细胞株，其中一株是中国仓鼠卵巢细胞株CHO/NS3‑GC1，能产生抗体NS3‑GC1，另一株是中国仓鼠卵巢细胞株CHO/NS3‑GC2，能产生抗体NS3‑GC2，所述细胞株已于2018年12月12日保藏于中国典型培养物保藏中心，保存编号依次为CCTCC NO.C2018186与NO.C2018187。利用本发明专利技术提供的两株细胞制备抗体量约为2g/L，较之前的杂交瘤细胞产量提高80倍，且抗体敏感性与之前的单抗一致，其组成抗体对与HCV NS3抗原特异性结合，可进行ELISA检测。

Engineering cell lines stably and efficiently expressing anti-HCV NS3 protein antibody and its application

The invention discloses a pair of engineering cell lines stably and efficiently expressing anti-HCV NS3 protein. One of them is CHO/NS3_GC1, a Chinese hamster ovary cell line, which can produce anti-NS3_GC1, and the other is CHO/NS3_GC2, which can produce anti-NS3_GC2. The cell lines have been stored in a typical culture preservation center of China on December 12, 2018, and the preservation number is in accordance with the code. The second is CCTCC NO. C2018186 and NO. C2018187. The amount of antibody prepared by the two cells provided by the invention is about 2g/L, which is 80 times higher than that of the previous hybridoma cells, and the sensitivity of the antibody is consistent with that of the previous monoclonal antibody. The composed antibody can specifically bind to the HCV NS3 antigen and can be detected by ELISA.

【技术实现步骤摘要】
稳定高效表达HCVNS3蛋白抗体的工程细胞株及其应用
本专利技术属于生物
，尤其涉及一对稳定高效表达HCVNS3蛋白抗体的工程细胞株及其应用。
技术介绍
丙型肝炎是慢性肝病的致病因素之一，而丙型肝炎主要是由于丙型肝炎病毒(HepatitisCvirus，HCV)感染引起的，全世界约有近1.8亿人口感染丙型肝炎病毒。HCV的慢性感染可导致肝脏慢性炎症坏死和纤维化，部分患者有可能发展为肝硬化甚至肝癌，严重危险人类健康。未来20年内与HCV感染相关的死亡率将继续增加，因此应该采取一切有效措施来避免感染。目前，尚不存在可用于预防HCV感染的疫苗，提早发现是及时治疗、隔离丙型肝炎感染者的主要方法。丙型肝炎的诊断主要依赖于丙型肝炎抗原和核酸的检测。但是，由于病毒RNA在感染者血清样品中易降解、较不稳定，因此，HCVRNA的检测无法适用于大规模人群筛查。开发HCV相关抗原检测试剂盒对提早发现、治疗携带者和控制病毒传播具有重要价值，对保证人民健康和维护公共安全具有深远意义。HCV是一种单链RNA病毒，基因组全长约9.6kb，编码长约3000氨基酸的多聚蛋白前体，形成四种结构蛋白：C、E1、E2、P7和NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B六种非结构蛋白。NS3蛋白在感染者体内出现时间早、持续时间长且具有较强的抗原性和免疫原性，是目前HCV检测中的主要候选抗原之一。基于此，寻找能够与NS3抗原具有高亲和力和特异性结合的抗体，有助于提高对于HCV感染者血清中NS3抗原检测的灵敏度和准确性，并且对提早发现、治疗携带者和控制病毒传播具有重要意义。利用杂交瘤细胞制备单克隆抗体对的技术已经成熟，目前也有利用杂交瘤细胞制备有关NS3抗原具有高亲和力和特异性结合的单克隆抗体或利用其开发HCV抗原检测试剂或试剂盒的报道，但该方法制备的检测NS3抗原的单克隆抗体量少，无法满足临床检验或相关检测试剂或试剂盒制备的需要。中国仓鼠卵巢细胞(CHO)是较为成熟的表达外源蛋白的哺乳动物细胞系，具有多年的实践运用经验。CHO细胞易于大规模培养，外源基因易于稳定整合入细胞的基因组，在表达外源蛋白中具有较大优势，利用它有望实现基因工程抗体的量产。但检索发现：目前，尚无以中华仓鼠卵巢细胞(CHO)作为宿主细胞，转染含有HCVNS3蛋白抗体基因的表达质粒筛选获得能够稳定高效表达HCVNS3蛋白抗体的工程细胞株的报道，也没有将CHO工程细胞用于HCVNS3蛋白抗体制备的应用报道。
技术实现思路
针对现有技术的不足，本专利技术的目的在于提供一对稳定高效表达HCVNS3蛋白抗体的工程细胞株及其应用。本专利技术所述的一对稳定高效表达HCVNS3蛋白抗体的工程细胞株，该工程细胞株是以中华仓鼠卵巢细胞(CHO)作为宿主细胞，转染含有能够特异性识别HCVNS3蛋白的单克隆抗体基因的表达质粒后经筛选获得；其特征在于：所述第一工程细胞株命名为中国仓鼠卵巢细胞株CHO/NS3-GC1，其能分泌产生HCVNS3蛋白抗体NS3-GC1，该细胞株已于2018年12月12日保藏于中国典型培养物保藏中心，保存编号为：CCTCCNO.C2018186；所述第二工程细胞株命名为中国仓鼠卵巢细胞株CHO/NS3-GC2，其能分泌产生HCVNS3蛋白抗体NS3-GC2，该细胞株已于2018年12月12日保藏于中国典型培养物保藏中心，保存编号为：CCTCCNO.C2018187。中国典型培养物保藏中心地址：中国，武汉，武汉大学。用于构建上述工程细胞株的真核细胞外源基因表达系统，其特征在于：所述表达系统包括真核表达载体和识别HCVNS3蛋白的抗体基因或编码HCVNS3蛋白的氨基酸序列或其抗原结合片段的核酸分子，其中所述真核表达载体选pBudCE4.1或pcDNA3.1，且该质粒带有Zeocin抗性作为筛选标签，该筛选标签能够通过转染DNA的方法导入细胞。其中：所述表达系统优先选择表达载体pBudCE4.1-HCVNS3-GC1和表达载体pBudCE4.1-HCVNS3-GC2；其中pBudCE4.1-HCVNS3-GC1的核苷酸序列如SEQNO.9所示，pBudCE4.1-HCVNS3-GC2的核苷酸序列如SEQNO.10所示。所述识别HCVNS3蛋白的抗体基因分别是编码命名为单克隆抗体3A10B5的核酸分子，同时也是编码基因工程抗体HCVNS3蛋白抗体NS3-GC1的核酸分子，其轻链的核苷酸序列如SEQIDNO.5所示，其重链的核苷酸序列如SEQIDNO.6所示，其中所述单克隆抗体3A10B5产生于CCTCCNO.C2018227的杂交瘤细胞株；或是编码命名为单克隆抗体7E3B6的核酸分子，同时也是编码基因工程抗体HCVNS3蛋白抗体NS3-GC2的核酸分子，其轻链的核苷酸序列如SEQIDNO.7所示，其重链的核苷酸序列如SEQIDNO.8所示，其中所述单克隆抗体7E3B6产生于CCTCCNO.C2018228的杂交瘤细胞株；所述两株杂交瘤细胞株已于2018年12月12日保藏于中国典型培养物保藏中心；所述编码HCVNS3蛋白的氨基酸序列如SEQNO.11所示。本专利技术所述的一对稳定高效表达HCVNS3蛋白抗体的工程细胞株在制备HCVNS3蛋白抗体中的应用。其中：培养工程细胞时能够显著提高抗体产量的专用培养基配方是：CHO-S-SFMII干粉培养基10g/L，NaHCO32.40～2.45g/L，7～8mM谷氨酰胺，2±0.2mM柠檬酸铁，最终pH为7.0～7.2；该培养基命名为CHO-Med-01；培养工程细胞时采用的补料方式是：于第1、3、5、7、9、11或13天分别依次补加终浓度为7ml/L、8ml/L、9ml/L、10ml/L、9ml/L、8ml/L、7ml/L的FeedA。进一步的，培养工程细胞时能够显著提高抗体产量的专用培养基配方优选是：CHO-S-SFMII干粉培养基10g/L，NaHCO32.45g/L，8mM谷氨酰胺，2mM柠檬酸铁，最终pH为7.1。本专利技术所述的一对工程细胞株分泌产生的HCVNS3蛋白抗体对，该基因工程抗体对包括独立存放的第一基因工程抗体和第二基因工程抗体；其特征在于：所述第一基因工程抗体命名为HCVNS3蛋白抗体NS3-GC1，由中国仓鼠卵巢细胞株CHO/NS3-GC1细胞分泌产生，其轻链的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示，其重链的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示；所述第二基因工程抗体命名为HCVNS3蛋白抗体NS3-GC2，由中国仓鼠卵巢细胞株CHO/NS3-GC2细胞分泌产生，其轻链的氨基酸序列如SEQIDNO.3所示，其重链的氨基酸序列如SEQIDNO.4所示。本专利技术所述的CHO工程细胞株对CHO/NS3-GC1和CHO/NS3-GC2能够分别稳定表达HCVNS3蛋白抗体NS3-GC1、NS3-GC2，具体为该细胞株对能够分泌表达抗体到细胞培养上清液中，所分泌的抗体能够通过酶联免疫吸附法(ELISA)检测。该细胞株在细胞数倍增1-40次后，抗体的表达水平稳定，即在相同的培养条件下，细胞数倍增1-40次后，通过酶联免疫吸附法(ELISA)检测，细胞培养上清液中抗体浓度保持在1.92-2.08g/L。使用亲和纯化的方式，能够从细胞培养上本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一对稳定高效表达HCV NS3蛋白抗体的工程细胞株，该工程细胞株是以中华仓鼠卵巢细胞(CHO)作为宿主细胞，转染含有能够特异性识别HCV NS3蛋白的单克隆抗体基因的表达质粒后经筛选获得；其特征在于：所述第一工程细胞株命名为中国仓鼠卵巢细胞株CHO/NS3‑GC1，其能分泌产生HCV NS3蛋白抗体NS3‑GC1，该细胞株已于2018年12月12日保藏于中国典型培养物保藏中心，保存编号为：CCTCC NO.C2018186；所述第二工程细胞株命名为中国仓鼠卵巢细胞株CHO/NS3‑GC2，其能分泌产生HCV NS3蛋白抗体NS3‑GC2，该细胞株已于2018年12月12日保藏于中国典型培养物保藏中心，保存编号为：CCTCC NO.C2018187。

【技术特征摘要】
1.一对稳定高效表达HCVNS3蛋白抗体的工程细胞株，该工程细胞株是以中华仓鼠卵巢细胞(CHO)作为宿主细胞，转染含有能够特异性识别HCVNS3蛋白的单克隆抗体基因的表达质粒后经筛选获得；其特征在于：所述第一工程细胞株命名为中国仓鼠卵巢细胞株CHO/NS3-GC1，其能分泌产生HCVNS3蛋白抗体NS3-GC1，该细胞株已于2018年12月12日保藏于中国典型培养物保藏中心，保存编号为：CCTCCNO.C2018186；所述第二工程细胞株命名为中国仓鼠卵巢细胞株CHO/NS3-GC2，其能分泌产生HCVNS3蛋白抗体NS3-GC2，该细胞株已于2018年12月12日保藏于中国典型培养物保藏中心，保存编号为：CCTCCNO.C2018187。2.用于构建权利要求1所述工程细胞株的真核细胞外源基因表达系统，其特征在于：所述表达系统包括真核表达载体和识别HCVNS3蛋白的抗体基因或编码HCVNS3蛋白的氨基酸序列或其抗原结合片段的核酸分子，其中所述真核表达载体选pBudCE4.1或pcDNA3.1，且该质粒带有Zeocin抗性作为筛选标签，该筛选标签能够通过转染DNA的方法导入细胞。3.根据权利要求2所述的真核细胞外源基因表达系统，其特征在于：所述表达系统选择表达载体pBudCE4.1-HCVNS3-GC1和表达载体pBudCE4.1-HCVNS3-GC2；其中pBudCE4.1-HCVNS3-GC1的核苷酸序列如SEQNO.9所示，pBudCE4.1-HCVNS3-GC2的核苷酸序列如SEQNO.10所示。4.根据权利要求2所述的真核细胞外源基因表达系统，其特征在于：所述识别HCVNS3蛋白的抗体基因分别是编码命名为单克隆抗体3A10B5的核酸分子，同时也是编码基因工程抗体HCVNS3蛋白抗体NS3-GC1的核酸分子，其轻链的核苷酸序列如SEQIDNO.5所示，其重链的核苷酸序列如SEQIDNO.6所示，其中所述单克隆抗体3A10B5产生于CCTCCNO.C2018227的杂交瘤细胞株；或是编码命名为单克隆抗体7E3B6的核酸分子，同时也是编码基因工程抗体HCVNS3蛋白抗体NS3-GC2的核酸分子，其轻链的核苷酸序列如SEQIDNO.7所示，其重链的核苷酸序列如SEQIDNO.8所示，其中所述单克隆抗体7E3B6产生于CCTCC...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱之炜，解光宁，陈振，任素平，欧兰香，王佳颖，武建伟，张日丽，瞿丽丽，
申请(专利权)人：山东莱博生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：山东,37