一株牛睾丸传代细胞株的建立及其应用制造技术

本发明专利技术涉及一株牛睾丸传代细胞株的建立及其应用。该方法包括：(1)利用新鲜牛睾丸制备原代细胞并建立牛睾丸细胞系ZJS‑1株；(2)采用单层细胞法培养牛睾丸传代细胞生产猪瘟活疫苗；(3)采用悬浮细胞法培养牛睾丸细胞生产猪瘟活疫苗。本发明专利技术建立的牛睾丸细胞系用于猪瘟活疫苗生产具有生产工艺简单且稳定、易操作，病毒含量高，批间差异小，质量易控，可显著提高疫苗产量和质量。利用本发明专利技术生产的猪瘟活疫苗安全性好、免疫效力高，对猪瘟强毒攻击具有完全的免疫保护作用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一株牛睾丸传代细胞株的建立及其应用，属于兽用生物制品领域。
技术介绍
我国目前生产猪瘟兔化弱毒疫苗所用的细胞为牛睾丸原代细胞和猪肾细胞。为了改进猪瘟病毒的培养工艺，特自主研发建立牛睾丸传代细胞株，又称牛睾丸细胞系，在此基础上建立基础种子批和生产种子批，并对其进行系统检定。猪瘟活疫苗为我国自主研发的安全及效力均优良的活疫苗，在世界范围内广泛应用，用于预防猪瘟病毒的感染。原生产用细胞为牛睾丸原代细胞，需采集新鲜牛睾丸进行制备，近年来随着牛病疫情的日趋复杂，采集新鲜牛睾丸制备生产用细胞存在外源病毒、细菌及支原体污染的风险，猪肾细胞作为生产用细胞是在牛睾丸原代细胞基础上的一个进步，作为猪源细胞，猪源的其他病毒也更容易适应该细胞，并在细胞上增殖，导致猪源病毒污染。这些外源因子的污染对活疫苗的安全性和效力构成严重威胁，对使用动物及环境可能造成巨大的损失。
技术实现思路
本专利技术的目的在于改进现有技术存在的不足之处，提供一种用牛睾丸传代细胞生产猪瘟活疫苗的方法。该方法具有生产工艺简单且稳定、易操作，病毒含量高，批间差异小，质量易控，可显著提高疫苗产量和质量，在转瓶细胞生产线和悬浮细胞生产线均可进行生产。利用本专利技术生产的猪瘟活疫苗安全性好、免疫效力高，对猪瘟强毒攻击具有完全的免疫保护作用。本专利技术的技术方案1.一株牛睾丸传代细胞株的建立，其特征在于该细胞系源自由新鲜牛睾丸制备的原代细胞，经传代后获得一株既适用于转瓶单层细胞培养，又适用于细胞悬浮培养工艺，且仍保持了对猪瘟病毒高度敏感性的牛睾丸传代细胞株，该株传代细胞株被命名为牛睾丸细胞系(Bovinetestiscellline)ZJS-1株，已于2016年8月23日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCCNo.12699。2.权利要求1所述一株牛睾丸传代细胞株的应用，其特征在于该株牛睾丸细胞采用单层细胞培养法和猪瘟病毒兔化弱毒株(AVCCNo.AV1412)用于猪瘟活疫苗的制备3.如权利要求2所述一株牛睾丸传代细胞系的应用，其特征在于该株牛睾丸细胞采用细胞悬浮培养法和猪瘟病毒兔化弱毒株(AVCCNo.AV1412)用于猪瘟活疫苗的制备。4.如权利要求2、3所述一株牛睾丸传代细胞株的应用，其特征在于其中的猪瘟病毒兔化弱毒株(AVCCNo.AV1412)是猪瘟病毒的脾淋毒接种良好单层的牛睾丸细胞或悬浮培养的牛睾丸细胞，加入3.5％血清维持液后置培养箱中培养，每日观察细胞状态，4～5日后收获病毒，按此方法继续传代病毒，取二收、三收细胞培养毒液作为生产用毒种。本专利技术具体实施方式1.牛睾丸传代细胞系的建立选取新出生健康犊牛，手术摘取睾丸，用Hanks液处理后加入0.25％胰酶溶液消化，弃去胰酶溶液，用玻璃珠振摇法分散细胞，静置培养成单层。将长成单层的牛睾丸细胞用0.25％胰酶分散并传代，传代至F50获得一株既适用于转瓶单层细胞培养，又适用细胞于悬浮培养工艺，且仍保持了对猪瘟病毒的高度敏感性的牛睾丸传代细胞株，该株传代细胞被命名为牛睾丸细胞系(Bovinetestiscellline)ZJS-1株，已于2016年08月23日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCCNo.12699。2.牛睾丸细胞微载体悬浮培养工艺的建立(1)单层细胞制备取出冻存的牛睾丸传代细胞P11代，置37℃水浴中解冻，1000r/min离心15min，弃掉上清，用含8％新生牛血清的DMEM培养基重悬接种110cm2培养瓶，置37℃、含5％CO2培养箱中培养至细胞长成致密单层，用0.25％胰酶/EDTA消化，按1:3～1:5传代，扩大培养。将扩大培养的牛睾丸传代细胞接种到3000ml细胞转瓶中，置37℃培养至细胞长成致密单层。控制转速为8～12r/h。(2)生物反应器培养条件实验室微载体悬浮培养牛睾丸传代细胞的条件确定为温度37℃，pH值7.2，溶氧50％，微载体浓度5g/L、搅拌转速40～45r/min(2L生物反应器)、45～50r/min(10L生物反应器)、细胞接种密度1.5×105个/mg～2.0×105个/mg。3.猪瘟细胞活疫苗的制备(1)细胞毒种的繁殖将猪瘟病毒兔化弱毒株(C株)脾淋毒接种良好单层的牛睾丸传代细胞或悬浮培养传代细胞，加3.5％血清维持液，置培养箱中培养，每日观察细胞状态，4～5日后收获病毒，按此方法继续传代病毒，取二收、三收细胞培养毒液作为生产用毒种；细胞毒种鉴定：细胞毒种鉴定完全符合猪瘟兔化弱毒株毒种标准，对猪安全无副作用，细胞毒种每1ml含病毒≥500,000个家兔感染量。(2)接种单层细胞制备猪瘟活疫苗取已形成良好单层的上述牛睾丸传代细胞培养瓶，弃去细胞生长液，接种含猪瘟病毒兔化弱毒株脾淋毒的细胞维持液，继续培养；接毒后第5日作第一次收获换液，以后每隔5日收获换液1次，收获的毒液置-20℃以下保存；将检验合格的病毒培养液，混合于同一容器内，加入稳定剂，同时加入抗生素，充分摇匀，定量分装；每头份含细胞毒液不少于0.015ml，分装后迅速进行冷冻真空干燥后即得成品。(3)按悬浮培养工艺制备猪瘟活疫苗取已形成良好单层的牛睾丸传代细胞，用0.25％胰酶/EDTA消化成单个细胞并计数。根据生物反应器培养体积，每升体积含微载体5g，按1.5×105～2.0×105个/mg细胞密度接入细胞后，加入含6％～8％新生牛血清的DMEM细胞培养液，在37℃、30～60r/min、pH值7.2、溶氧50％的条件下培养，每日取样进行细胞观察及消化计数。当一级生物反应器中微载体细胞计数不低于4.0×106个/ml时，停止搅拌，待微载体细胞完全沉淀后，弃去生长液，将生长良好的BT细胞微载体经收料管收集至细胞消化瓶中，用PBS(0.01mol/L，pH值7.2)清洗2次，用0.25％胰酶/EDTA消化后取样计数。根据二级生物反应器培养体积，按1.5×105～2.0×105个/mg细胞密度接入二级生物反应器进行放大培养，当二级生物反应器中微载体细胞计数不低于3.0×106个/ml时，弃去生长液，加入含1％～3.5％新生牛血清或马血清的DMEM细胞维持液，以MOI为0.1～0.5接种生产毒种后，在37℃、30～60r/min、pH值7.2、溶氧50％的条件下培养，接毒后5日做第一次收获换液(停止搅拌，沉淀，收获上清液，再加入含1％～3.5％新生牛血清或马血清的DMEM细胞维持液)，以后每隔4日收获换液一次，收获次数不超过8次。置-15℃以下保存，不超过6个月。将检验合格的病毒培养液，混合于同一容器内，加入稳定剂，同时加入抗生素，充分摇匀，定量分装；每头份含细胞毒液不少于0.015ml，分装后迅速进行冷冻真空干燥后即得成品成品检验：按《中国兽药典》(中国兽药典委员会.中国华人民共和国兽药典2005年版三部.中国农业出版社，2006，本专利技术以下称《中国兽药典》)进行检验，应符合“猪瘟活疫苗(细胞源)”规定的指标，对猪安全无副作用。每头份疫苗含病毒≥7500个家兔感染量。上述技术方案中，所述含猪瘟本文档来自技高网...

【技术保护点】
一株牛睾丸传代细胞株的建立，其特征在于该细胞系源自由新鲜牛睾丸制备的原代细胞，经传代后获得一株既适用于转瓶单层细胞培养，又适用于细胞悬浮培养工艺，且仍保持了对猪瘟病毒高度敏感性的牛睾丸传代细胞株，该株传代细胞株被命名为牛睾丸细胞系(Bovine testis cell line)ZJS‑1株，已于2016年8月23日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC No.12699。

【技术特征摘要】
1.一株牛睾丸传代细胞株的建立，其特征在于该细胞系源自由新鲜牛睾丸制备的原代细胞，经传代后获得一株既适用于转瓶单层细胞培养，又适用于细胞悬浮培养工艺，且仍保持了对猪瘟病毒高度敏感性的牛睾丸传代细胞株，该株传代细胞株被命名为牛睾丸细胞系(Bovinetestiscellline)ZJS-1株，已于2016年8月23日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCCNo.12699。2.权利要求1所述一株牛睾丸传代细胞株的应用，其特征在于该株牛睾丸细胞采用单层细胞培养法和猪...

【专利技术属性】
技术研发人员：薛青红，冯忠武，冯忠泽，陈光华，印春生，顾进华，孙淼，张广川，支海兵，
申请(专利权)人：中国兽医药品监察所，
类型：发明
国别省市：北京;11