一种重组细胞系、其制备方法和应用技术

本发明专利技术属于生物技术领域，公开了一种重组细胞系、其制备方法和应用。本发明专利技术提供的重组细胞系OP9-lhx2为在骨髓基质细胞OP9中导入表达Lhx2的基因，实现过表达Lhx2，该细胞系为诱导多能干细胞和/或胚胎干细胞定向分化为血液细胞提供了必要的微环境，成功诱导多能干细胞和/或胚胎干细胞分化为血液细胞，显著提高了诱导效率，为诱导多能干细胞和/或胚胎干细胞定向血液细胞分化提供了新的方法。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物
，特别涉及一种重组细胞系、其制备方法和应用。
技术介绍
细胞疗法为一些遗传性疾病、恶性疾病的治疗带来了新的希望，细胞替代治疗是细胞疗法中的一种。目前临床上最常用的细胞替代治疗手段是造血干细胞在血液遗传性疾病(如再生障碍性贫血)及恶性白血病中的应用，这需要合适的造血干细胞，所以，造血干细胞的来源成为了该技术推广与应用的技术难题。目前，骨髓、被激活的外周血及脐带血为主要的造血干细胞来源，这些来源的造血干细胞数量少，体外扩增能力有限，且异体移植配型困难也严重限制了该方法的应用。根据研究报道，通过诱导多能干细胞和/或胚胎干细胞可以定向分化为造血干细胞在内的血液细胞，在适当条件下可进一步分化称为各种血细胞。目前诱导多能干细胞和/或胚胎干细胞定向分化为血液细胞的方法主要有三种：(1)主要通过体外形成拟胚体(EB)，然后在成分确定的无血清培养基中培养，之后结合可溶性因子诱导获得；(2)主要通过体外多能干细胞和/或胚胎干细胞与造血微环境基质细胞的共培养获得造血干细胞；(3)主要通过体内注射多能干细胞和/或胚胎干细胞形成畸胎瘤方法来产生造血干细胞。研究报道，通过拟胚体形成的中胚层细胞与OP9细胞(小鼠骨髓基质细胞)共培养可以获得造血祖细胞，但没有获得造血干细胞。无血清培养拟胚体时，通过加入造血发育相关细胞因子来时续性诱导，可以分化成血管内皮细胞，经OP9衍生细胞系OP9-DL1和OP9-DL4细胞共培养可获得含分化为淋系在内的永久造血前体细胞。2013年，首次报导了从畸胎瘤中分离到具有重构造血功能的造血干细胞，之后通过基因修饰的iPS细胞(Lnk-/-)结合环境细胞OP9以及造血关键因子SCF、TPO组合方式可以直接在体内畸胎瘤中产生造血干细胞，并能通过新生血管迁移到受体鼠的骨髓。分离这些细胞做移植可重构造血系统。借用畸胎瘤体内造血技术，注射非基因修饰ES和人iPS一样也可以获得功能性造血干细胞，这是目前公认的从多能干细胞和/或胚胎干细胞诱导产生功能性造血干细胞，进而获得血液细胞的唯一途径。但是，该方法效率极低，而且相关报道能否重复未知，所以，还需要不断的科学研究来寻求新的诱导多能干细胞和/或胚胎干细胞向血液细胞分化的方法。
技术实现思路
本专利技术的专利技术目的在于提供一种重组细胞系、其制备方法和应用。本发明提供的重组细胞系可用于诱导多能干细胞和/或胚胎干细胞向血液细胞分化，显著提高了诱导效率。本专利技术提供的一种重组细胞系OP9-lhx2细胞系，为在骨髓基质细胞OP9细胞中导入Lhx2的基因并过表达Lhx2。骨髓基质细胞为(bone marrow stromal cells，BMSCs)是造血微环境的重要组成成分，可以分泌多种与造血有关的正负调控因子，发挥调控造血的作用。在本专利技术的一些实施例中，本专利技术提供的重组细胞系中所用的骨髓基质细胞为OP9细胞。Lhx2是LIM同源结构域(LIM homeodomain，简称LIM-HD)转录因子家族中的一员，在多个系统中发挥着重要作用，影响机体的生长与发育。在本专利技术中Lhx2的基因具有如NCBI NM_001290646所示的核苷酸序列。本专利技术提供的重组细胞系在骨髓基质细胞OP9中导入了表达Lhx2的基因，实现了Lhx2过表达。该细胞系为诱导多能干细胞和/或胚胎干细胞定向分化为血液细胞提供了必要的微环境，成功诱导多能干细胞和/或胚胎干细胞分化为血液细胞。本专利技术还提供了所述重组细胞系的制备方法，包括：通过病毒载体向骨髓基质细胞OP9中转染表达Lhx2的基因，即得。优选地，本专利技术提供的制备方法中，所用的病毒载体为逆转录病毒载体。更为优选地，本专利技术提供的制备方法中，所用的逆转录病毒载体为pMYs系列逆转录病毒载体。在本专利技术的另外一些实施例中，本专利技术提供的制备方法具体为：获得表达Lhx2的DNA分子；以pMYs-IRES载体为骨架，将所得表达Lhx2的DNA分子整合到pMYs-IRES载体中，获得重组病毒载体；将重组病毒载体导入逆转录病毒包装细胞系进行包装，收集包装病毒上清液；取所得包装病毒上清液，转染骨髓基质细胞。本专利技术所述制备细胞系的方法，经检测阳性率达90％以上。本专利技术提供的制备方法以逆转录病毒载体介导表达Lhx2的基因导入骨髓基质细胞OP9中，获得了过表达Lhx2的重组细胞系，在所得骨髓基质细胞中导入表达Lhx2的基因。本专利技术还提供了重组细胞系在诱导多能干细胞和/或胚胎干细胞向血液细胞分化中的应用。在本专利技术中，本专利技术提供的重组细胞系能够为诱导多能干细胞和/或胚胎干细胞定向分化为血液细胞提供必要的微环境，成功诱导多能干细胞和/或胚胎干细胞分化为血液细胞，包括造血干细胞。在本专利技术的一些实施例中，本专利技术提供的重组病毒载体中的病毒载体为逆转录病毒载体。在本专利技术的另外一些实施例中，本专利技术提供的重组病毒载体中的逆转录病毒载体为pMYs系列逆转录病毒载体。在本专利技术的另外一些实施例中，本专利技术提供的重组病毒载体具体为pMYs-IRES-GFP。本专利技术还提供了一种利用所述重组细胞系体外诱导多能干细胞和/或胚胎干细胞向血液细胞分化的方法，该方法包括：取该骨髓基质细胞与多能干细胞和/或胚胎干细胞共培养。本专利技术提供的利用重组细胞系诱导多能干细胞和/或胚胎干细胞向血液细胞分化的方法，实现了在体外诱导多能干细胞和/或胚胎干细胞向血液细胞定向分化。在本专利技术的一些实施例中，本专利技术提供的诱导多能干细胞和/或胚胎干细胞向血液细胞分化的方法，具体为：取骨髓基质细胞，贴壁生长后，接种多能干细胞和/或胚胎干细胞至所述骨髓基质细胞上，共培养5天～13天，收集并富集CD34+细胞；取所得CD34+细胞接种于新的所述骨髓基质细胞上，培养5天～13天，收集细胞。在本专利技术的另外一些实施例中，本专利技术提供的诱导多能干细胞和/或胚胎干细胞向血液细胞分化的方法中，接种多能干细胞和/或胚胎干细胞的步骤，具体为：取多能干细胞和/或胚胎干细胞，用Dispase酶消化多能干细胞和/或胚胎干细胞，收集多能干细胞和/或胚胎干细胞，稀释得多能干细胞和/或胚胎干细胞悬浮液；将所得多能干细胞和/或胚胎干细胞悬浮液加到贴壁生长后所得的骨髓基质细胞上。在本专利技术的另外一些实施例中，本专利技术提供的诱导多能干细胞和/或胚胎干细胞向血液细胞分化的方法中，收本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种重组细胞系，其特征在于，在骨髓基质细胞OP9细胞中导入Lhx2的基因并过表达Lhx2。

【技术特征摘要】
1.一种重组细胞系，其特征在于，在骨髓基质细胞OP9细胞中导入Lhx2
的基因并过表达Lhx2。
2.一种如权利要求1所述重组细胞系的制备方法，其特征在于，包括：
通过病毒载体向骨髓基质细胞OP9中转染Lhx2基因。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述病毒载体为逆转
录病毒载体。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述逆转录病毒载体
为pMYs系列逆转录病毒载体。
5.根据权利要求2述的制备方法，其特征在于，具体为：以pMYs-IRES
载体为骨架，将Lhx2cDNA阅读框亚克隆方式插入，构建pMYs-Lhx2-IRES
载体，载体经酶切、测序鉴定正确导入包装细胞，收集包装病毒上清，感染
OP9细胞系。
6.如权利要求1所述的重组细胞系在诱导多能干细胞和/或胚胎干细胞向
血液细胞分化中的应用。
7.一种利用如...

【专利技术属性】
技术研发人员：王金勇，陈晓梨，耿阳，赵乾浩，黄可，
申请(专利权)人：中国科学院广州生物医药与健康研究院，
类型：发明
国别省市：广东;44