本发明专利技术涉及表达重组蛋白的细胞系的产生，所述细胞系用于分泌性治疗分子的裸细胞生物递送和胶囊化细胞生物递送。在一个实施方案中，细胞系是人的细胞系。在本发明专利技术的另一方面中，转座子系统用于产生用于生物活性多肽分泌的细胞系。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及表达重组蛋白的细胞系的产生，所述细胞系用于分泌性治疗分子的裸细胞生物递送和胶囊化细胞生物递送。在一个实施方案中细胞系是人的细胞系。
技术介绍
向细胞中引入DNA的典型方法包括浓缩DNA的试剂、包含脂质的试剂以及病毒介导的策略。然而，这些方法具有局限性。例如，浓缩DNA试剂和病毒介导的策略存在大小限制。此外，在病毒策略中转染进入细胞的核酸的量受限制。此外，病毒介导的策略可以是细胞类型特异性的或组织类型特异性的，并且当体内使用病毒策略时会产生免疫问题。克服这些问题的一个适宜的方法是转座子。转座子或转座元件是可在单个细胞基因组内移来移去并整合在不同部位的DNA序列，这是一个称作转座的过程。转座子包括在其上游和下游带有倒转重复序列的短核酸。活性转座子编码称作转座酶的促进切下核酸并插入到靶DNA序列内的酶。转座子向染色体内的整合提供了长期或可能永久在转基因细胞和生物体中表达转基因的基础。转座子系统具有广的转基因应用范围。迄今为止，已经研究了转座子系统在昆虫幼体内的体内蛋白质生产，其中将转座子质粒直接注射入昆虫前胚盘胚中(W0 2001/29204)。然后从发育中的幼体或成体昆虫纯化目的蛋白质。还已经利用转座子系统遗传修饰干细胞。WO 2009/050657涉及使用转座子-转座酶系统产生遗传修饰干细胞的方法。在干细胞中表达的转基因是处于在干细胞和分化细胞中均为组成型的启动子控制下的标志物基因，例如GFP。在WO 2009/071334中，描述了使用通过转座子系统修饰的精原干细胞产生敲除或者转基因动物模型的方法。因此，在本领域当前技术水平众所周知，转座子可以用于产生转基因细胞系，或者产生敲除细胞系或者产生转基因细胞系，因此改变细胞的特性。由于转座子长期或者可能永久性整合入染色体中，所以在转基因细胞和生物体中实现转基因表达。在基于细胞的治疗法中，其中产生稳定的人转基因细胞系用于随后作为或者胶囊化细胞或者裸细胞移植入受试者中，需要在植入后稳定高表达转基因，例如在其中不能使用选择标记的条件下。有代表性地，移植的细胞和植入的胶囊化细胞必须能够表达转基因达1年或更长，而没有任何下调，例如由基因沉默引起的下调。传统的增强表达的工具例如密码子优化、表达增强序列的使用或者强启动子的使用具有局限性并且可能产生变异的结^ ο在本专利技术中，在用于植入的胶囊生产中采用了转座子系统的特性，其中所述胶囊包含使用转座子系统改变成分泌生物活性化合物或多肽或者促进所述生物活性肽产生的 siRNA的细胞。胶囊的外膜是生物相容性的并且胶囊包含支持细胞的基质。
技术实现思路
因此，在第一个方面中，本专利技术涉及用于向受试者递送分泌性生物活性化合物的8胶囊。胶囊包括a.生物相容性外膜和内核，b.所述内核包含细胞，c.所述细胞包含含有下列结构基因的异源表达构建体i.编码分泌性生物活性多肽的结构基因，或者ii.编码促进细胞中产生分泌性生物活性化合物的多肽或SiRNA的结构基因，d.所述基因位于其为转座酶或者其它整合酶底物的两个反向重复序列之间。该胶囊使得在植入后稳定高表达转基因成为可能，并且转座子系统的使用与传统的细胞转染相比使转基因表达增加数倍。在另一个方面中，本专利技术涉及本专利技术的胶囊用于治疗的用途。由于本专利技术的胶囊稳定且高水平地并且在缺乏选择压力下产生生物活性化合物，它们特别适宜于在治疗中使用。由于表达水平更高，所以可降低胶囊的数量和/或大小。在另一个方面中，本专利技术涉及细胞系，包含编码下列结构基因的异源表达构建体i.编码分泌性生物活性多肽的结构基因，或者ii.编码促进细胞中产生分泌性生物活性化合物的多肽或SiRNA的结构基因；所述基因位于其为转座酶底物的两个反向重复序列之间。通过使用转座子系统产生细胞系，甚至在低拷贝数时观察到分泌多肽的增加。因此在缺乏选择压力下达到高效率和意外的稳定转基因表达。通过使用细胞系，保证了组合物中的所有细胞是相同的。在另一个方面中，本专利技术涉及产生重组蛋白的方法，包括培养本专利技术的细胞和回收所述重组蛋白。有代表性地，在重组表达中，至少在细胞扩大培养过程中维持选择压力以保证细胞没有丢失转基因。由于本专利技术的细胞系可以在没有选择压力下转基因稳定表达和高水平表达，所以可以避免在重组生产过程中使用选择压力，例如使用抗生素。由此，使随后的下游加工变得容易。在进一步的方面中，本专利技术涉及产生能够分泌生物活性化合物的细胞系的方法， 所述方法包括a.以第一和第二表达构建体转染细胞；b.所述第一表达构建体包含编码转座酶的阅读框；c.所述第二表达构建体编码分泌性生物活性多肽或者编码促进细胞中产生分泌性生物活性化合物的多肽或siRNA ；d.所述第二表达构建体位于其为所述转座酶底物的两个反向重复序列之间；e.使所述座酶瞬时表达，由此使所述第二构建体整合入所述人细胞的基因组中。通过使用转座子系统产生分泌多肽的细胞系，达到分泌性多肽的更高产量。通过使用转座子系统，较少需要连续选择压力，因为转基因细胞倾向于不降低表达。附图说明MJA :2D，8周研究，甘丙肽克隆.体外稳定分泌甘丙肽的ARPE-19克隆基于pCA 表达载体，使用标准转染技术和G418选择产生克隆，不传代培养克隆8周，通过ELISA测量9甘丙肽的分泌；SIB :2D, 8周研究，SB IgSP-甘丙肽克隆.体外稳定分泌甘丙肽的ARPE-19克隆基于SB底物载体pT2，使用SB技术产生克隆，不传代培养克隆直到8周，通过ELISA测量甘丙肽的分泌；SIC 对临床NGF克隆的2D测试.体外稳定分泌NGF的ARPE-19克隆基于pCA 表达载体，使用标准转染技术和G418选择产生克隆，不传代培养克隆8周，通过ELISA测量 NGF的分泌；MID 对临床SB-NGF克隆的2D测试.体外稳定分泌NGF的ARPE-19克隆基于SB 底物载体PT2，使用SB技术产生克隆，不传代培养克隆8周，通过ELISA测量NGF分泌；Ml 在迷你猪中的甘丙肽4周体内研究.使用SB技术产生的胶囊化SB-甘丙肽克隆SB-IgSP-M对使用标准转染技术产生的克隆ppG-152的丙甘肽表达水平，植入前数值 (蓝色柱)与外植体数值(红色柱)相比并且体外并行运行装置(黄色柱)，将装置植入迷你猪的海马内；S3 在大鼠中的NGF 8周体内研究.使用SB技术产生的胶囊化SB-甘丙肽克隆 SB-NGF-78对使用标准转染技术产生的克隆NGC-0295的NGF表达水平，植入前数值(蓝色柱)与外植体数值(红色柱)相比并且体外并行运行装置(黄色柱)，将装置植入大鼠的纹状体内。具体实施例方式定义生物学活性指分子对特定细胞的生物学上有益的作用。如本文所使用，“生物活性化合物”是从产生其的细胞释放或分泌并且对分开的靶细胞起作用的化合物。如本文所使用，“生物相容性胶囊”意思是指这样的胶囊，即当植入到宿主哺乳动物内时没有引起足以导致排斥胶囊或者使其不适合，例如通过降解的有害宿主反应。如本文所使用，术语“生物学试剂”指任何试剂，例如病毒、蛋白质、肽、氨基酸、脂质、碳水化合物、核酸、核苷酸、药物、前药或者由细胞产生的对细胞具有作用的其它物质， 而不论此种作用是有害、有益的还是其它方式。如本文所使用，“编码序列”是被转录和翻译成多肽的多核苷酸序列。如本文所使本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种用于向受试者递送分泌性生物活性化合物的胶囊，胶囊包括ａ．生物相容性外膜和内核，ｂ．所述内核包含细胞，ｃ．所述细胞包含含有下列任一结构基因的异源表达构建体ｉ．编码分泌性生物活性多肽的结构基因，或，ｉｉ．编码促进细胞中产生分泌性生物活性化合物的多肽或ｓｉＲＮＡ的结构基因，ｄ．所述基因位于作为转座酶或者其它整合酶底物的两个反向重复序列之间。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：菲利普·库斯克，拉尔斯·U·沃尔伯格，
申请(专利权)人：Ns基因公司，
类型：发明
国别省市：DK
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