帕金森氏病的体内基因治疗制造技术

本发明专利技术涉及用于基因治疗的方法和组合物，特别是涉及递送生物活性Ｎｅｕｒｔｕｒｉｎ治疗帕金森氏病的体内基因治疗。另一方面，本发明专利技术涉及病毒表达构建体，它包含与成熟或Ｎ－末端截短的Ｎｅｕｒｔｕｒｉｎ连接的哺乳动物信号肽，在信号肽与Ｎｅｕｒｔｕｒｉｎ之间无功能性原区（ｐｒｏｒｅｇｉｏｎ）。这些病毒表达构建体是在体内基因治疗中有效分泌生物活性Ｎｅｕｒｔｕｒｉｎ所必需的。本发明专利技术还涉及能够大量产生Ｎｅｕｒｔｕｒｉｎ的哺乳动物细胞以及使用这些细胞用于重组生产生物活性Ｎｅｕｒｔｕｒｉｎ和用于治疗用途。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及用于基因治疗的方法和组合物，具体涉及用于递送生物活性Neurturin以治疗帕金森氏病的体内基因治疗。另一方面，本专利技术涉及病毒表达构建体，它包含与成熟或N-末端截短的Neurturin连接的哺乳动物信号肽，在该信号肽与Neurturin之间无功能性原区(proregion)。这些病毒表达构建体是在体内基因治疗中有效分泌生物活性Neurturin所必需的。本专利技术还涉及能够产生增加的量的Neurturin的哺乳动物细胞以及使用这些细胞在重组制备生物活性Neurturin中的用途以及治疗用途。
技术介绍
帕金森氏病(PD)是影响1至1百50万美国人的破坏性神经变性疾病。每年诊断出超过35,000个新病例。帕金森氏病的发病率在超过50岁的群体中最高，但在更年轻的患者中也报道了惊人数量的新病例。帕金森氏病的主要特征是运动缓慢(运动徐缓)，手，胳膊，腿，颌，和颜面震颤或发抖，四肢和躯干僵硬，且姿势不稳定。随着这些症状的发展，患者的行走，说话，或完成其它简单的日常生活工作可能出现困难。这些行为缺陷与大脑的黑质纹状体系统变性相联系，该系统负责产生流畅的，有目的的运动。具体地说，位于黑质中的神经细胞变性并伴随着由这些细胞产生的多巴胺丧失。黑质神经细胞将轴突或突起伸展进入纹状体，在纹状体中分泌和利用多巴胺。估计在PD症状出现前纹状体内需要发生80％的多巴胺损失。目前，左旋多巴(levodopa)(商品名为Sinemet)是用于帕金森氏病的主要疗法。在大脑中，左旋多巴转化成多巴胺，矫正帕金森氏病患者大脑中的多巴胺不足。当左旋多巴与外周脱羧酶抑制剂卡比多巴(carbidopa)联合施用时，PD患者表现出明显受益。然而，问题是尽管左旋多巴疗法减轻了PD症状，但是它没有替代损失的神经细胞且不会阻止该疾病的进展。随着PD的进行，患者需要增加左旋多巴的剂量且可能出现副作用，最显著的是无意识运动的能力丧失和僵直。事实上，运动障碍专家通常推迟使用左旋多巴且最初使用其它多巴胺能(dopaminergic)药物，以便在该疾病过程的后期当患者最需要时使用左旋多巴。因此，左旋多巴具有其局限性且需要建立用于帕金森氏病的其它治疗策略。在这点上，重新激起了手术治疗PD的兴趣。最近，一种称为深度脑刺激的操作引起了相当大的关注。在该操作中，将电极放在PD患者过度活跃的脑区域使得对这些脑区域的电刺激矫正过度反应性。在一些患者中，获得了显著的效果。其它手术介入致力于改善黑质纹状体系统的功能。移植多巴胺能细胞改善帕金森氏病动物模型中的运动神经元缺陷已有成功。人类多巴胺能细胞移植的初步临床试验已经成功，尽管个别双盲临床试验揭示了年轻患者而不是老年患者受益。然而，一些接受移植的患者发展成无意识运动的能力丧失。因此，目前，细胞移植仍然认为是一种实验探索。另一方法致力于给予黑质纹状体系统生长因子以试图防止黑质神经元变性及神经递质多巴胺的伴随损失。全世界的许多实验室已经证实神经胶质细胞系衍生的神经营养因子(GDNF)在大鼠和灵长类进行的试验中可防止黑质纹状体系统变性的结构和功能后果。使用蛋白质注射，通过泵和通过体内基因治疗施用在临床前试验中实现了将GDNF施用到CNS中。许多研究描述了使用表达GDNF的AAV或慢病毒转导CNS细胞(Kordower，Ann Neurol，200353(suppl 3)，s120-s134；WO 03/018821，Ozawa等；US 2002187951，Aebischer等；Georgievska等，2002，Exp Nero 117(2)，461-474；Georgievska等；2002，NeuroReport 13(1)，75-82；Wang等，2002，Gene Therapy，9(6)，381-389；US 2002031493，Rohne-Poulenc Rorer SA；US6,180,613，Roecketeller University；Kozlowski等，2000，Exp Neurol，166(1)，1，15；Bensadoun 2000，Exp Neurol，164(1)，15-24；Connor等，1999，Gene Therapy，6(12)，1936-1951；Mandel等，1997，PNAS，94(25)，14083-88；Lapchak等，1997，Brain Research，777(1，2)，153-160；Bilang-Bleuel等，1997，PNAS 94(16)，8818-8823)。治疗帕金森氏病的其它体内基因治疗方案包括用表达芳香L-氨基酸脱羧酶(AADC)，suthalamic谷氨酸脱羧酶(GAD)的病毒来转导(Marutso，NipponNaika Gakkai Zasshi，2003，92(8)，1461-1466；Howard，Nature Biotechnology，2003，21(10)，1117-18)。尽管GDNF似乎是用于治疗人类帕金森氏病有希望的候选物，但是据报道GDNF治疗引起某些副作用，主要是体重减轻和异常性疼痛(Hoane等，1999，160(1)235-43)。因此，本领域需要开发治疗帕金森氏病的替代性策略，特别是致力于防止黑质神经元变性的策略。Neurturin是GDNF生长受体家族中的一员且主要通过GFRα2受体传导信号。NTN和GDNF的受体在空间和时间上均差异表达。因此，可预料到NTN和GDNF的治疗效果是不同的。比较通过渗透型微型泵施用的GDNF和NTN证实了这点(Hoane等，1999，160(1)235-43)。在用6-羟多巴胺诱导变性的成人多巴胺能神经元(与本专利技术人所用的动物模型相同)进行的回体基因治疗研究中比较GDNF和NTN，作者注意到GDNF和NTN都阻止了黑质多巴胺能神经元的死亡，但是仅GDNF诱导酪氨酸羟化酶染色强度增强和大量萌发(massive sprouting)(Akerud等，J Neurochemistry，73，170-78)。作为蛋白质配制品或者通过移植过量表达NTN的细胞将Neurturin施用到PD模型的CNS没有产生与用GDNF获得的结果相当的结果。在蛋白质治疗研究中，这可能是由于Neurturin蛋白质配制品的稳定性存在问题(沉淀和半寿期短)。迄今为止没有报道使用Neurturin体内基因治疗帕金森氏病。使用表达Neurturin的AAV的一个基因治疗研究集中在治疗视网膜疾病(Jomary等，2000，Molecular Vision 736-41)。然而，作者推断治疗视网膜退化的rd模型似乎不受单纯调节NTN或GFRα-2表达的影响。因此至今使用Neurturin的体内基因治疗仍是推测性的。本专利技术概要本专利技术人基于将GDNF家族生长因子通过病毒转导给予6-OHDA损伤模型的纹状体中进行了一系列临床前的动物试验。6-OHDA损伤模型是帕金森氏病的熟知动物模型。这些实验令人吃惊地表明用编码Neuturin的病毒转导产生了至少与用GDNF通过转导获得的效果一样好的治疗性效果。这些数据提供了在帕金森氏病模型中通过体内基因治疗给予Neurturin的效果的首份临床前证据。Neurturi本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种治疗帕金森氏病的方法，所述的方法包括向需要的个体的中枢神经系统施用治疗上有效量的病毒表达载体，所述的载体包含启动子序列，该启动子序列能够指导可操作相连的多肽的表达，所述的多肽包含能够在哺乳动物细胞中发挥功能的信号肽，并且所述多肽包含选自原－ＮＴＮ，成熟ＮＴＮ，Ｎ－末端截短的成熟ＮＴＮ，和任一所述ＮＴＮ的序列变异体组成的组的人，鼠（ｍｕｒｉｎｅ）或大鼠Ｎｅｕｒｔｕｒｉｎ（ＮＴＮ）。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：詹斯托诺埃，卡尔罗森布拉德，拉斯瓦尔伯格，
申请(专利权)人：Ns基因公司，
类型：发明
国别省市：DK[丹麦]