新型细胞系和方法技术

本发明专利技术涉及新型细胞和细胞系以及制备和使用它们的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及新型细胞和细胞系以及用于制备和使用它们的方法。在具体的实施方案中，本专利技术涉及稳定地表达复杂靶标(complex target)的细胞和细胞系。本专利技术还提供了制备此类细胞和细胞系的方法。本文中提供的细胞和细胞系用于鉴定此类复杂靶标的调节剂。
技术介绍
目前，据报导制药公司的药物开发项目的工业平均失败率为大约98%。虽然这包括该过程的所有阶段的失败，但高失败率意味着迫切需要在过程效率中的任何改善。促成高失败率的一种因素是缺乏表达治疗性靶标的细胞系，所述治疗性靶标在药物开发过程中的基于细胞的功能测定中使用。毫无疑问地，使用基于细胞的测定的研究，特别是药物开发研究，将获益于在基于细胞的测定中使用的细胞和细胞系。因此，迫切需要快速和有效地建立基于细胞的测定以用于更快速开发新的和改良的药物。优选地，为了更有效的药物开发，测定系统应提供生理学上更加相关的调节剂在体内的效应的预测物。除需要基于细胞的测定外，还需要改良细胞用于蛋白质生产、基于细胞的疗法和各种其它用途。因此，存在对表达功能性目的蛋白质或RNA的细胞和细胞系的急切需要。在口中，可在包括舌、腭的部分、会厌、喉和咽的几个特化区域中发现味觉受体细胞(TRC)。在舌上，TRC被组织成称为味蕾的细胞群。味蕾由单个顶孔组成，其中TRC的微绒毛与存在于口腔内的促味剂(tastant)接触。在舌上，味蕾埋在三类特化表皮结构中。菌状乳头分布在舌的前三分之二上。在舌的后三分之一的侧面上发现在出生时良好发育的但随着年龄增长退化的叶状乳头。7至9个轮廓乳头位于后舌上远至接近界沟的后部。除了味蕾中有组织的‘经典’TRC外，在肺和肠的非舌上皮中发现了化学感受性细胞簇(chemosensory cell cluster)或单独的化学感受性细胞(solitary chemosensory cell)。甜味受体甜味感觉由两个亚单位TASR2(T1R2)和TASR3(T1R3)组成的异聚G蛋白偶联受体 (GPCR)介导。该受体被称为甜味受体。受体的两个亚单位是C类GPCR亚家族的成员并且具有大N端胞外域，通常称为捕蝇夹域(venus flytrap domain) 0 TlR亚单位可偶联至G 蛋白α转导蛋白(transducin)或α味转导素(gustducin)，通过所述G蛋白它们可激活磷脂酶C(PLC) β 2-依赖性途径以增加胞内Ca2+浓度。它们还可激活cAMP依赖性途径。甜味受体检测多种甜味化学品，包括单一碳水化合物(例如糖)、氨基酸、肽、蛋白质和合成甜味剂。甜味受体对天然和人造甜味剂都很敏感。鉴于多种已知激活受体的化学结构，已提出受体中存在多个结合位点，包括跨膜区中的位点和T1R3上的位点，所述T1R3 用作与鲜味受体共有的亚单位。甜味受体也牵涉病症例如肥胖症和糖尿病，因为此类受体似乎在营养物检测和感觉中起着重要作用。味觉受体在人的近端小肠的营养物检测区中表达，其中证据表明它们在检测肠腔中的营养物方面起作用。在该区域中，更具体地在肠的内分泌细胞中存在甜味受体和味转导素(参与细胞内味觉信号传导的G蛋白)的高度协同表达。因此此类甜味受体的功能可显示与其它G蛋白偶联受体相似的配体介导的控制，即，它们可在其高浓度的配体存在的情况下失去其活性和/或表达。这可产生响应血液和腔中葡萄糖浓度的动态代谢变化的肠‘味觉’信号传导。因此，甜味受体和其在肠中的调节可在饮食、食欲以及在多种疾病例如肥胖症和糖尿病的治疗中具有重要作用。由天然糖和人造甜味剂对肠甜味受体的激活还导致增加的顶端葡萄糖转运蛋白(apical glucose transporter)、GLUT2和其它葡萄糖转运蛋白的表达。例如，人造甜味剂具有营养活性，因为它们可使功能性味觉接受系统(functional taste reception system)发出信号以在进餐过程中增加糖的吸收，这在营养和食欲中、从而在营养不良和进食障碍的潜在治疗中是可具有重要意义的发现。始终升高的顶端GLUT2水平导致增加的糖吸收并且为实验性糖尿病以及由果糖和脂肪诱导的胰岛素抵抗状态的特征。此外，神经内分泌细胞中甜味受体的激活导致胰高血糖素样肽(GLP-I)和可能的其它消化调节剂的释放。总体而言，肠中的甜味受体在感觉肠腔内容物的营养价值中起着重要作用并且通过受调节的吸收和消化帮助协调身体的反应。这些发现表明，甜味受体可用作用于治疗肥胖症和糖尿病的调节剂的可能的靶标。鲜味受体美味(鲜味)感觉由2个亚单位TASRl (TlRl)和TASR3(T1R3)组成的异聚GPCR 介导。该受体被称为鲜味受体。受体的两个亚单位都是C类GPCR亚家族的成员并且具有通常称为捕蝇夹域的大N末端胞外域。TlR亚单位可偶联至G蛋白α转导蛋白或α味转导素，通过所述G蛋白它们可激活磷脂酶C(PLC) 2-依赖性途径以增加细胞内Ca2+浓度。它们还可激活cAMP-依赖性途径。此类受体可检测许多种美味化学物质包括L-氨基酸和谷氨酸单钠(MSG)。也已显示TlRl结合5'-肌苷酸二钠(IMP)和其它核苷酸、已知的鲜味增强剂。鲜味受体也在人的近端小肠的营养物检测区中表达，在所述区域中，它们被认为在检测肠腔中的营养物方面起作用。在该区域中，具体地在神经内分泌细胞中，存在鲜味受体和味导蛋白(参与细胞内味觉信号传导的G蛋白)的高度协同表达。氨基酸对肠鲜味受体的激活导致顶端寡肽转运蛋白PepTl的调节。总体而言，肠中的鲜味受体在感觉肠腔内容物的营养价值中起着重要作用并且通过受调节的吸收和消化帮助协调身体的反应。这些发现表明鲜味受体可用作用于治疗肥胖症和糖尿病的调节剂的可能的靶标。苦味受体苦味受体是在味觉受体细胞的表面上表达的G蛋白偶联受体(GPCR)并且被偶联至第二信使途径。TAS2R受体可以例如被偶联至转导蛋白(例如，GNATl、GNAT2和鸟嘌呤核苷酸结合蛋白G(t))或味导蛋白(例如，GNAT3鸟嘌呤核苷酸结合蛋白和α转导蛋白3)， 通过所述蛋白它们可激活磷酸二酯酶和磷脂酶C(PLC) β 2-依赖性途径以增加胞内Ca2+浓度。TAS2R受体还可被偶联至人GNA15(鸟嘌呤核苷酸结合蛋白(G蛋白)α 15 (Gq种类；异名GNA16)和小鼠Ga 15以及它们的嵌合蛋白Ga 15-GNA15 (也称为G a 15_Gal6)。人苦味由人TAS2受体(hTAS2R)基因家族的约25个成员介导。苦味受体除了在味觉中的作用之外在一系列生理背景中也是非常重要的。例如，味觉受体激动剂在肠内分泌细胞体外以及在动物体内诱发分泌应答，并且诱导神经元活化。因此，所有苦味受体家族成员是管理多种与苦味促味剂的检测相关的状况的重要的临床靶标。特异性靶向味觉受体(例如，甜味受体、鲜味受体和苦味受体)并且由此调节它们的活性的新型和改良化合物的发现一直受阻于缺乏稳健的生理学相关的基于细胞的系统，更具体地易于进行高通量形式处理以鉴定和测试味觉受体调节剂(例如，甜味受体调节剂、鲜味受体调节剂和苦味受体调节剂)的此类系统。此类基于细胞的系统对于药物发现和确认是优选的，因为相对于仅提供结合测定的无细胞系统它们为化合物提供了功能测定。此外，基于细胞的系统具有同时测试细胞毒性的优点。理想地，基于细胞的系统还应当稳本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种用于分离内源地表达甜味受体Ｔ１Ｒ２亚单位和／或甜味受体Ｔ１Ｒ３亚单位的细胞的方法，其中所述方法包括下列步骤：ａ．提供一群细胞；ｂ．将检测Ｔ１Ｒ２的表达的信号传导探针引入细胞和／或将检测Ｔ１Ｒ３的表达的分子信标引入细胞；ｃ．分离表达甜味受体Ｔ１Ｒ２亚单位和／或甜味受体Ｔ１Ｒ３亚单位的细胞。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：K·夏柯达，D·梭茱克，P·M·沙阿，
申请(专利权)人：卓莫赛尔公司，
类型：发明
国别省市：US