本发明专利技术提供一种适用于筛选用于重组蛋白制造的新颖的细胞系开发方法。所述方法利用存在于相关基因的表达载体中的膜锚定的报告基因或细胞内报告基因以便通过FACS或MACS进行原始细胞选择。可以使用转换机制通过提供合适DNA重组酶使所述报告基因从染色体中缺失，此将所选细胞变成分泌相关蛋白质而不共表达所述报告基因的生产细胞。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】【专利说明】 相关申请的夺叉引用 本申请要求2012年11月30日提交的美国临时申请第61/732, 156号的优先权利 益，所述申请明确地以全文引用的方式并入本文中。 序列表 本申请含有序列表，所述序列表已以ASCII格式以电子方式提交且特此以全文引 用的方式并入本文中。所述ASCII拷贝创建于2013年11月27日，被命名为34166-00002_ SL.txt，并且大小是33, 232个字节。 本专利技术技术涉及细胞系开发和蛋白质生产，并且更具体来说涉及一种将表达膜锚 定的报告基因（MAR)的细胞转化成向培养基中分泌相关蛋白质（P0I)的生产细胞的转换机 制。
技术介绍
重组治疗性蛋白质被广泛用于治疗从癌症到不孕症的众多人类疾病。所 述重组治疗性蛋白质包括各种凝血因子、胰岛素、生长激素、酶、Fc融合蛋白、单克 隆抗体以及其它蛋白质（斯科特C(ScottC),国际生物制药工程工艺（Bioprocess Int. )10(6):S72-S78,2012)。由于对正确折叠和翻译后修饰（包括糖基化）的需要，所以 使用哺乳动物宿主细胞制造了许多重组治疗性蛋白质。其中，治疗性抗体代表蛋白质疗法 的最大部门之一，其中在2011年约30种经过批准的抗体疗法占约500亿美元的全球市场。 主要的治疗性抗体来自抗体发现程序，属于以下四个类别：嵌合抗体、人类化抗 体、来自合成人类抗体文库的用各种展示系统选择的完全人类抗体以及来自携带人类免疫 球蛋白基因的转基因动物的完全人类抗体（查恩斯P.(ChamesP.)等人，英国药理学杂志 (BrJPharmacol.) 157 (2): 220-233, 2009)。含有人类恒定区和非人类可变区的嵌合抗体 在人体内造成了免疫原性风险并且因此就治疗性应用来说已经失去了人类化或完全人类 抗体的益处。人类化抗体含有90-95%人类残基和5-10%为抗原相互相用所必需的非人类 残基，然而完全人类抗体含有100 %人类残基。人类化和完全人类抗体在用于治疗各种疾病 的治疗性应用方面均已经取得了巨大的成功。 治疗性抗体的开发通常需要10-15年，包括抗体发现、工程改造、生产细胞系开 发、制造工艺开发以及临床研宄。在这些任务中，抗体发现会需要6-18个月并且生产细胞 系开发会再需要6-10个月。当前抗体发现方法的最大问题之一是它们不采用最终抗体产 品的格式，其通常是全长人类IgG。所选抗体通常是需要在生产细胞系开发之前重新格式化 成最终IgG格式的鼠抗体或人类抗体的片段，例如scFv或Fab。重新格式化有时在下游工 艺开发中导致出人意料的问题，包括活性损失、低表达水平、聚集、不可溶性和/或不稳定 性。因此，可能需要其它的抗体工程改造和优化，导致损失了宝贵的时间并增加了成本。 细胞系开发是用于获得任何治疗性蛋白质（包括抗体）的生产细胞系的工艺的 关键部分。生产细胞系应该是高产的、稳定的，并且具有正确的产品质量属性，包括生物 活性、蛋白质序列均匀性、糖基化概况、电荷变异体、氧化、脱氨基以及低聚集水平。CH0细 胞是用于生产治疗性蛋白质的最常用哺乳动物细胞。如NSO或SP2/0细胞的其它哺乳动 物细胞也被用于生产生物疗法（贾亚帕KR(JayapalKR)等人，化学工程进展（Chemical EngineeringProgress) ,103:40-47, 2007;李F(LiF)等人，MAbs. 2 (5): 466-477, 2010)。 常规细胞系开发利用基因扩增系统，通过并入二氢叶酸还原酶OHFR)或谷氨酰胺合成酶 (GS)作为选择标记。通常，在细胞系开发程序中通过在96孔组织培养板中限制稀释克 隆，筛选出最多1000个克隆。获得高产细胞系需要通过在稳定转染之后例如在DHFR系统 中使用甲氨蝶呤（Methotrexate;MTX)或在GS系统中使用氨基亚砜蛋氨酸（Methionine SUlph〇Ximine;MSX)添加选择压力来进行基因扩增。在大多数情况下，产率通常是唯一的 选择准则直到所述工艺中当仅评定少数克隆的对大规模制造来说重要的其它质量属性时 的很晚阶段为止，导致项目风险增加并且引起关于下游开发的复杂问题。 选择适用作重组蛋白生产细胞系的相关细胞群体的方法可以涉及细胞表面或 细胞内报告基因分子的表达。细胞内报告基因（例如GFP)的高表达水平已经显示出具 细胞毒性（刘HS(LiuHS)等人，生物化学与生物物理研宄通讯（BiochemBiophysRes Commun), 260:712-717, 1999 ;华莱士LM(WallaceLM)等人，分子疗法?核酸（Molecular TherapyNucleicAcids). 2,e86, 2013)，然而，报告基因的细胞毒性通过细胞表面展示降 到最低。 已经开发出展示技术用于蛋白质（例如抗体）的高通量筛选。抗体展示系统已被 成功地应用于筛选、选择和表征抗体片段。这些系统通常依赖于噬菌体展示、大肠杆菌展示 或酵母展示。每个展示系统都具有其优势和弱点，然而一般来说，这些系统缺乏翻译后修饰 功能或展现与哺乳动物细胞不同的翻译后修饰功能并且往往展示小抗体片段而不是全长 IgG。因此，生物活性的表征和经分离抗体片段的进一步开发通常需要转化成整个免疫球蛋 白和在哺乳动物细胞中表达以便进行恰当折叠和翻译后加工。这种转化工艺可以产生具有 不同于初始筛选中所选择的抗体的结合特征的结合特征的抗体。 存在对用于选择产生重组蛋白的细胞系（例如产生抗体的细胞系）的改良工艺的 需要，其中选择工艺有助于基于除产率以外的质量属性进行快速细胞系选择。本专利技术提供 用于筛选和选择用于重组蛋白生产的细胞系的改良组合物和方法。
技术实现思路
本专利技术的额外特征和优点将在以下描述中加以阐述，并且在某种程度上根据所述 描述将是明显的，或者可以通过对本文中所公开的原理的实践习得。本专利技术的特征和优点 可以借助于本文所提供的公开内容和实例来实现并获得。本专利技术的这些和其它特征将从以 下描述和所附权利要求书变得更完全显而易见，或者可以通过对本文中所阐述的原理的实 践习得。 本专利技术涉及一种转换机制，所述转换机制可以在选择提供P0I的最佳表达的细胞 亚群之后关闭报告基因（例如，细胞表面或细胞内报告基因）的表达。所述报告基因可以 是GFP或可通过FACS、MACS或可有效地检测报告基因的任何其它分析方法检测的任何其 它分子。报告基因的表达在功能上与P0I的表达有关，以使得报告基因是P0I表达的替代 物。以上提到的转换机制可以用于将展示细胞表面膜锚定的报告基因（MAR)或细胞内报告 基因的细胞变成分泌P0I的生产细胞。公开了并入有通过位点特异性DNA重组酶识别序列 (DRRS)侧接、被插入到相关基因（GOI)的表达载体中的MAR的序列的一系列分子设计。报 告基因盒可以存在于启动子与G0I之间或在G0I的下游在内部核糖体进入位点（IRES)或 另一启动子之后。在两种情况下，将首先允许报告基因表达以促进通过FACS或MACS进行 细胞选择并且然后通过恰当位点特异性DNA重组酶的瞬时表达或向细胞直接提供所述恰 当位点特异性DNA重组酶来消除报告基因表达，以便转换细胞以产生P0I而不共表达所述 本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种DNA构筑体，其包含(a)启动子；(b)相关基因GOI；以及(c)通过DNA重组酶识别序列DRRS侧接的报告基因。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：余波，詹姆斯·拉里克，
申请(专利权)人：落叶松生物科学公司，
类型：发明
国别省市：美国;US
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