本发明专利技术公开了一种高覆盖度检测转基因烟草的标准对照质粒及其应用。所述标准对照质粒pGMT27包含烟草内源基因NR和Actin序列及转基因烟草中高频使用的外源基因P-35S、T-NOS、NPT II、GUS、HPT、Bar和aadA序列，此标准对照质粒分子可作为阳性对照标准品用于高覆盖度转基因烟草的定性和定量PCR检测筛选工作，解决了转基因烟草的阳性标准品匮乏等问题，保障了我国烟草及烟草制品转基因安全相关工作的顺利进行。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物
，涉及一种高覆盖度检测转基因烟草的标准对照质粒及 其应用。
技术介绍
近年来，转基因技术飞速发展，转基因作物及其产品大量涌现，但由于其对人体健 康和生物多样性的影响未经长期检验，转基因作物及其产品所引起的安全性问题备受关 注，而烟草及烟草制品作为特殊消费品，各国消费者对转基因烟草均采取"零"容忍态度，烟 草的转基因检测已成为烟草国际贸易的重要壁皇。 在进行转基因检测时，需要设置阳性对照确保检测结果的可靠性，尤其是在定量 PCR检测时需要阳性标准对照物质来绘制标准曲线，用以定量样品中的转基因成分含量。 转基因检测所采用的标准对照物质主要有基体标准物质和质粒标准物质，质粒标准物质是 指含有外源基因和内源基因特异性核苷酸序列的重组质粒分子，较基体标准物质具有更稳 定和高效等优点。国内外已获得多种作物转基因检测用的质粒标准物质，例如检测转基因 大豆356043、转基因玉米M0N810和转基因玉米NK603的质粒标准物质分别是ERM-AD425、 ERM-AD413和ERM-AD415,并已成为有证标准物质全世界推荐使用，但是，至今国际上仍无 专业的机构或单位研宄和生产检测转基因烟草的标准对照物质，更无标准质粒物质的使用 和报道，已成为制约国际上检测烟草转基因技术可靠性和稳定性的主要技术瓶颈，严重影 响了我国烟草进出口贸易的安全。因此，根据多年在烟草转基因检测上的经验，我们从国际 公共数据库获得了能够100%覆盖目前已知转基因烟草特征的7个靶标基因及其核苷酸序 列，首次构建出一种高覆盖度检测转基因烟草的标准对照质粒，并建立了相应的烟草转基 因检测方法和体系。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种高覆盖度检测转基因烟草的对照质粒，所构建的对照质 粒PGMT27可以作为检测烟草转基因过程中的阳性对照物质，满足烟草转基因安全监管和 筛查检测工作的需求。 本专利技术具体通过以下技术方案实现： 利用NCBI PubMed、中国知网等数据库，获得能100%覆盖已知转基因烟草特征的 烟草外源高频使用的革E标基因序列7个：P_35S(GenBank accession number :AF485783， 4974. ? 5808,846bp)、T_N0S(GenBank accession number :AF485783,4022. ? 4277, 256bp)、 NPT II (GenBank accession number :AF485783,2838. .3632,795bp)、GUS(GenBank accession number :AF485783, 5845. ? 7656,1812bp)、HPT (GenBank accession number ： AF354045,8948. ? 9973,1026bp)、Bar (GenBank accession number :AJ251014,980. ? 1524， 545bp)和 aadA(GenBank accession number :EU497669,3544. .4335,792bp)，并从 NCBI Nucleotide获得这7个基因和2个常用的烟草内源基因Actin (GenBank accession number :X63603,4269..4640,372bp)和 NR(GenBank accession number :JN384019， 445. ? 1456,1012bp)的核苷酸序列。 -种高覆盖度检测转基因烟草的标准对照质粒，包括烟草外源基因和内源基因， 所述的烟草外源基因为P-35S、T-NOS、NPT II、⑶S、HPT、Bar和aadA，所述的烟草内源基因 为 Actin 和 NR。 其中P-35S为花椰菜花叶病毒CaMV 35S启动子，T-N0S为农杆菌胭脂碱合成酶基 因终止子，NPT II为大肠杆菌新霉素磷酸转移酶编码基因（为卡那霉素抗性基因），⑶S为 大肠杆菌葡萄糖苷酸酶基因（为报告基因），HPT为大肠杆菌潮霉素磷酸转移酶编码基 因（为潮霉素抗性基因），Bar为吸水链霉菌草丁膦乙酰辅酶A转移酶编码基因（为草丁膦 抗性基因），aadA为原核生物氨基糖苷-3' -腺苷酸转移酶编码基因（为壮观霉素抗性基 因）；Actin为烟草肌动蛋白基因，NR为烟草硝酸还原酶基因。所述的标准对照质粒为按 P-35S、T-NOS、NPT II、⑶S、HPT、Bar、aadA、Actin、NR 连接顺序组成的核酸片段。 本专利技术所述的标准对照质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。 本专利技术所述的标准对照质粒通过以下方法构建： 1)利用NCBI PubMed、中国知网等数据库，获得能100%覆盖已知转基因烟草特征 的烟草外源高频使用的靶标基因序列7个：P-35S、T-N0S、NPT II、⑶S、HPT、Bar和aadA，并 从NCBI Nucleotide获得这7个基因和2个常用的烟草内源基因Actin和NR的核苷酸序 列。 2)人工合成左右两端分别增加Sac I及EcoR I酶切位点的核苷酸序列： HPT+Bar+aadA+Actin+NR，通过MCS (多克隆位点）插入到常规克隆载体pMD18T。 3)使用Sac I和EcoR I双酶切pMD18T和常规植物表达载体pBI121，将核苷酸片 段HPT+Bar+aadA+Actin+NR切下，插入到pBI 121中，获得标准对照质粒pGMT27。 本专利技术经过PCR扩增验证，结果证明上述构建的标准质粒可作为转基因烟草筛选 检测时阳性对照品。 该标准质粒可在转基因烟草定性筛选检测时作为阳性对照物质，解决了阳性标准 品的缺乏问题。 本专利技术的有益效果为：该质粒可用于转基因烟草定性筛选、监测，作为转基因检测 用的阳性对照物质或阳性标准品，解决了转基因烟草的阳性标准品匮乏等问题，保障了我 国烟草及烟草制品转基因安全相关工作的顺利进行。【附图说明】 图1质粒标准分子pGMT27质粒图谱； 图2定性PCR检测L0D值； 图3 pGMT27质粒NR基因定量PCR检测标准曲线； 图4 pGMT27质粒P-35S基因定量PCR检测标准曲线。【具体实施方式】 下面结合实施例对本专利技术做进一步的说明，以下所述，仅是对本专利技术的较佳实施 例而已，并非对本专利技术做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示 的
技术实现思路
加以变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本专利技术方案内容，依据本专利技术 的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改或等同变化，均落在本专利技术的保护范围内。 实施例1标准对照质粒pGMT27的构建 一、实验试剂常规克隆载体 pMD18-T、DNA Ligation Kit LONG、dNTPs、rTaq 酶、DL lOOMarker、 DL 2000Marker、DL 5000Marker、限制性内切酶Sac I、EcoR I、Sac II为大连宝生物工程有 限公司产品；大肠杆菌DH5a菌株为北京全式金生物技术有限公司产品；核酸染料GelRedTM lOOOOXin water 为 BI0TIUM 公司产品。 所述人工合成序列：HPT+Bar+aadA+Ac本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种高覆盖度检测转基因烟草的标准对照质粒，其特征在于：包括烟草外源基因和内源基因，所述的烟草外源基因为P‑35S、T‑NOS、NPT II、GUS、HPT、Bar和aadA，所述的烟草内源基因为Actin和NR。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：余婧，赵杰宏，邹颉，付强，郭玉双，任学良，
申请(专利权)人：贵州省烟草科学研究院，
类型：发明
国别省市：贵州;52
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