一种利用烟草高效表达IL‑37各亚型成熟蛋白的方法技术

本发明专利技术公开了一种利用烟草高效表达IL‑37各亚型成熟蛋白的方法，在信号肽和成熟IL‑37蛋白编码序列之间插入TEV蛋白酶及其酶切位点编码序列形成IL‑37‑TEV 融合基因；根据烟草密码子的偏好性，在保证氨基酸序列不变的情况下，对融合基因序列进行优化；将构建的IL‑37‑TEV 融合基因的5'端上游与常用的启动子包括其他调节区域连接，并在3'端下游与转录终止子连接；将构建的重组表达载体通过转化整合到烟草细胞染色体上，培育高效稳定表达IL‑37 的转基因烟草植株以及通过注射构建的重组表达载体到烟草叶瞬时表达目的蛋白。本发明专利技术通过构建植物表达载体,在植物中表达具有高度活性的IL‑37成熟蛋白，所得产品对治疗诸多炎症疾病和炎症疾病的早期检测和诊断具有重要应用价值。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及基因工程和蛋白质表达领域，具体涉及一种利用烟草高效表达IL-37各亚型成熟蛋白的方法。
技术介绍
人白介素-37(IL-37)是细胞因子IL-1族中新添加的一成员，于2000年发现。与IL-1族中的其它成员相反，IL-37属于抗炎症细胞因子具有广泛的抗炎功效，在限制固有炎症反应(innateinflammation）和抑制获得性免疫（acquiredimmunity）反应两个方面都起着关键的作用。体外实验研究发现，抑制人细胞内IL-37的正常表达会增加由IL-1，Toll样受体（Toll-linkreceptor，TRL）和尿酸结晶誘发的炎性细胞因子的表达和释放，包括TNF-α，IL-1α，IL-1ß，IL-6和G-CSF。尽管到目前为止在小鼠身上还没有发现与人相对应的IL-37基因，但人IL-37在小鼠体内具有活性。用构建的表达IL-37转基因小鼠(IL37-tg）研究其对不同炎症疾病的影响，结果发现，IL-37-tg小鼠展现出对多种炎症相关疾病的抵抗力，如内毒素血症，结肠炎，脊髓损伤，代谢综合症，心肌缺血等。此外，注射重组IL-37蛋白质到非IL-37转基因的正常小鼠，可同样地保护由内毒素血症，代谢综合症如肥胖引起的II型糖尿病，急性肺部损伤，脊髓损伤，心肌梗死，哮喘和肝脏缺血等疾病对动物所造成的损伤。还有，很多人类炎症疾病的严重程度和IL-37在体内的表达量相关联。例如，炎症性肠疾病患者的结肠组织中有IL-37表达，但健康个体的相应组织中不存在。类风湿关节炎患者体内IL-37水平升高，某些患者的IL-37基因编码区出现突变，他们的下肢关节疾病得分相对无突变的患者要低，暗示这种突变增强了IL-37抗炎症反应的功能。检测感染HIV-1患者的外周血液发现，其IL-37的稳台态（steadystate）mRNA浓度相对未感染者要高4倍。这些结果提示炎症会增加机体内IL-37表达，而IL-37表达量的增加有助于对疾病症状的控制。一般认为，IL-37抑制炎症反应的分子机制是通过和IL-18竟争与IL-18受体（IL-18receptor）的结合。IL-37结合到IL-18Rα上后，复合体会捕捉到孤儿誘捕受体（orphandecoy）IL-1R8与之结合，随后IL1R8的TLRb结合区吸引MyD88(myeloiddifferentiationfactor88)与之结合.这一相互间的作用能激活细胞内的信号通路用于阻断炎症的发生，包括对MAPKS和NF-KB的抑制，mTOR信号通路的抑制以及对抗炎症通路STAT3，MerandPTEN的激活。同时，因为MyD88分子被困，它参与IL-1和IL-18信号通路的程度也相应降低。IL-37对抗原特异性获得性免疫的抑制主要是通过耐受树突状细胞的产生。因此，IL-37不仅可能提供一种治疗诸多炎症疾病的新的有效方法，而且还有可能用于炎性疾病的早期检测和诊断。目前只有大肠杆菌表达生产小量重组人IL-37作试剂用，远不能满足作为新型检测，诊断和治疗疾病手段的需求，迫切需要开发另外一种表达系统能够廉价大批量生产高活性的重组IL-37蛋白质。植物作为一种生物反应器生产具有医药用途或其他具有商业价值的外源蛋白已展现出聚大的优势和竟争力，具有广阔的市场前景。植物作为重组蛋白生产系统有很多优点：(1)低成本、易大规模商业化生产。植物能进行光合作用，仅需要来自土壤的矿物质和水分便可在适宜的条件下获得大量人们所需的转基因产物。扩大生产规模容易，只需要很少量的再投入。这与微生物和动物细胞表达系统形成明显的对照。动物细胞培养需要使用昂贵的培养基。扩大生产规模需要大量新的投资包括购买昂贵的新设备（如发效罐等）；(2)由于动物和人病毒无法跨界感染植物细胞，植物表达生产的药物蛋白受人或动物病毒感染的机会很小，因此，與动物细胞生产的药物蛋白比較，植物生产的药物蛋白临床使用更安全；(3)作为高等真核细胞生物，植物细胞和动物细胞一样可以对新合成的蛋白质进行翻译后加工修饰，如糖基化（glycosylation）、磷酸化(phosphorylation)and亚基组装（subunitassembly），因此表达产物具有与高等动物细胞一样的免疫原性和生物活性。细菌作为生物反应器时，不能对真核生物的蛋白进行有效的翻译后加工，仅适合表达结构简单非糖化的蛋白质，而且本身可能是人类病原物。烟草(Nicotianatabacum)作为表达平台具有其他植物生产体系不可比拟的优点。首先，自1989年第一次用烟草表达抗体[3]以来，烟草已经成为生产重组蛋白的主要平台；其次，烟草是叶子植物产量高，且叶片可溶性蛋白含量高，作为重组蛋白生产平台可提高外源蛋白在植物中的表达量；再次，烟草的遗传转化技术非常成熟，重组蛋白在烟草中的表达可选择不同的方式，比如细胞核表达(转基因植物)、叶绿体表达和瞬时表达；最后，烟草既不是人类食物，也不是饲料作物，因此降低了转基因材料污染食物链或饲料链的风险。IL-37基因位于人类第二号染色体上，其基因表达产物共有五个剪切亚型(isoformsatoe)。目前的研究主要集中在IL-37b，对于其他亚型的功能还不太了解。不过因IL-37a和IL-37d的结构与IL-37b相似，即它们的编码区都包含第四个外显子，可以编码β-三叶草结构。此结构被认为是IL-1家族细胞因子的特征性结构.所以推测和IL-37b一样，IL-37a和IL-37d具有生物学功能。而IL-37c和IL-37e缺乏第四个外显子，不能编码β-三叶草结构，推测它们可能没有生物学功能或与IL-37b的功能有所不同。IL-37在多种组织中表达，包括血液单核细胞，组织聚吞噬细胞，滑膜细胞，扁桃体B细胞，浆细胞，肿瘤细胞以及皮肤，肾脏和肠道的上皮细胞。IL-37剪切亚型的分布也有一定的组织特异性。例如，IL-3a主要在大脑中表达，IL-37b主要存在于肾脏，心脏特异性表达IL-37c，而IL-37d和IL-37e则主要在骨髓和睾丸中表达。IL-37的五个亚型都是先合成蛋白前体，切除信号肽后产生成熟蛋白。但它们的信号肽都非经典序列。信号肽的切割主要由半胱天冬酶-1（caspase-1）完成。不过最新的研究认为IL-37信号肽的完全切割需要别的酶参与其中。在IL-37的五个亚型中，IL-37b蛋白链最长，由218个氨基酸组成，含一个45个氨基酸组成的N端信号肽。虽然IL-37b前体和IL-37b成熟蛋白形式都发现有活性，但IL-37b成熟蛋白的活性比IL-37b前体蛋白的活性高出20-30倍。IL-37成熟蛋白也可以进入细胞核与核DNA结合从而影响基因转录，而其前体蛋白则不能。人IL-37天然以二聚体形式（dimer）存在，但二聚体的形成不是以共价键(二硫鍵)方式连接。到目前为此，在植物细胞中还没有发现编码caspase-1酶的基因，尽管某些植物蛋白质序列表现出与动物caspases酶一定的相似性。这意味着当用植物细胞表达IL-37基因时，获得的表达产物是IL-37前体而非成熟蛋白，因植物细胞无法识别位于IL-37前体的N末端信号肽序列並加以剪切。目前，一种可能的方法是只把编码成熟IL-37的基因在植物细胞内表达，但此方法具有明显本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种利用烟草高效表达IL‑37各亚型成熟蛋白的方法，其特征在于，包括以下步骤：S1. 设计IL‑37‑TEV融合基因：包括在信号肽和IL‑37成熟蛋白各亚型编码序列之间插入TEV蛋白酶及其酶切位点编码序列获得融合基因、在IL‑37成熟蛋白各亚型的天然信号肽和TEV蛋白酶序列间添加一段柔性连接肽，所述IL‑37‑TEV融合基因的基本结构顺序为：自身原始信号肽‑柔性连接肽‑TEV蛋白酶‑TEV酶识别位点‑成熟蛋白各亚型IL‑37编码序列；所述IL‑37成熟蛋白各亚型为IL‑37a、IL‑37b、IL‑37c、IL‑37d和IL‑37e，其中， IL‑37a‑TEV融合基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，IL‑37b‑TEV融合基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，IL‑37c‑TEV融合基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，IL‑37d‑TEV融合基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，IL‑37e‑TEV融合基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；其IL‑37a‑TEV融合基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示，IL‑37b‑TEV融合基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示，IL‑37c‑TEV融合基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示，IL‑37d‑TEV融合基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示，IL‑37e‑TEV融合基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示；所述柔性连接肽序列如SEQ ID NO.11所示；S2. 构建重组表达载体：将步骤S1设计的IL‑37‑TEV融合基因连接到过渡载体PRTL‑2‑Gus，经酶切分离后再克隆到植物表达双元空载体的T‑DNA ，获得IL‑37成熟蛋白各亚型的重组表达载体；S3.表达：将步骤S2构建的重组表达载体导入到烟草中进行表达。...

【技术特征摘要】
1.一种利用烟草高效表达IL-37各亚型成熟蛋白的方法，其特征在于，包括以下步骤：S1.设计IL-37-TEV融合基因：包括在信号肽和IL-37成熟蛋白各亚型编码序列之间插入TEV蛋白酶及其酶切位点编码序列获得融合基因、在IL-37成熟蛋白各亚型的天然信号肽和TEV蛋白酶序列间添加一段柔性连接肽，所述IL-37-TEV融合基因的基本结构顺序为：自身原始信号肽-柔性连接肽-TEV蛋白酶-TEV酶识别位点-成熟蛋白各亚型IL-37编码序列；所述IL-37成熟蛋白各亚型为IL-37a、IL-37b、IL-37c、IL-37d和IL-37e，其中，IL-37a-TEV融合基因的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，IL-37b-TEV融合基因的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示，IL-37c-TEV融合基因的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示，IL-37d-TEV融合基因的核苷酸序列如SEQIDNO.4所示，IL-37e-TEV融合基因的核苷酸序列如SEQIDNO.5所示；其IL-37a-TEV融合基因编码的氨基酸序列如SEQIDNO.6所示，IL-37b-TEV融合基因编码的氨基酸序列如SEQIDNO.7所示，IL-37c-TEV融合基因编码的氨基酸序列如SEQIDNO.8所示，IL-37d-TEV融合基因编码的氨基酸序列如SEQIDNO.9所示，...

【专利技术属性】
技术研发人员：马生武，安托尼·迈克尔·耶尼卡，邓绍平，杨洪吉，魏亮，
申请(专利权)人：马生武，安托尼·迈克尔·耶尼卡，邓绍平，杨洪吉，魏亮，
类型：发明
国别省市：四川;51