H9亚型AIV、H6亚型AIV和AIV的三重RT‑PCR试剂盒及其应用制造技术

本发明专利技术公开了用于鉴定或辅助鉴定H9亚型禽流感病毒和/或H6亚型禽流感病毒和/或禽流感病毒的引物对组。利用本发明专利技术所提供的引物对组建立的三重RT‑PCR，可准确鉴定H9亚型禽流感病毒和/或H6亚型禽流感病毒和/或禽流感病毒，且特异性好，灵敏度高，对H9亚型禽流感病毒、H6亚型禽流感病毒和禽流感病毒的最小检出限均达到5×104拷贝。因此，本发明专利技术所提供的引物对组可同时检测H9亚型禽流感病毒、H6亚型禽流感病毒和禽流感病毒，具有重要的应用价值。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物
，具体涉及一种H9亚型AIV、H6亚型AIV和AIV的三重RT-PCR试剂盒及其应用。
技术介绍
禽流感病毒(Avian influenza virus，AIV)属于正黏病毒科，A型流感病毒属。目前的研究表明，AIV根据其表面的血凝素蛋白(Hemagglutinin，HA)和神经氨酸酶蛋白(Neuraminidase，NA)抗原的差异可以划分为16种HA亚型(H1～H16)和9种NA亚型(N1～N9)。另外，根据病毒对鸡致病性的强弱又可将其分为低致病性禽流感病毒(Low pathogenic avian influenza，LPAIV)和高致病性禽流感病毒(Highly pathogenic avian influenza，HPAIV)。长期以来，因为LPAIV造成的家禽损失较小而往往被人们忽视和轻视。近年来的研究表明，LPAIV可以通过基因重组进而造成人类流感的大流行，其中H9亚型AIV和H6亚型AIV就是这类LPAIV中最重要的两个亚型之一。研究表明近年来新出现的可感染人的H7N9、H10N8、H6N1和H5N6亚型流感病毒的部分基因来自于H9N2亚型AIV。1997年香港地区发现的感染人的高致病性H5N1亚型AIV的7个基因来源于H6亚型AIV，这说明低致病性H6亚型AIV有可能为H5亚型HPAIV提供内部基因。2013年5月，台湾地区发现了首例H6N1亚型AIV直接感染人的案例。另外，血清学抗体调查表明H9亚型AIV和H6亚型AIV都可以感染人。因此，H9亚型AIV和H6亚型AIV对人类公共卫生安全具有重要意义，引起了广泛的关注。病毒分离鉴定是AIV检测的一种经典的方法，但该方法存在检测周期较长的缺点。目前检测AIV的方法主要是血清学和分子生物学方法，而血清学方法则需要标准阳性血清，具有一定的局限性。分子生物学检测方法具有快速准确等优点，特别是多重PCR具有操作简便，特异性高，敏感性好，省时省力等特点而得到了广泛的应用。研究表明，H6亚型AIV和H9亚型AIV在家禽中比较常见且有混合感染的情况存在。H9亚型AIV和H6亚型AIV混合感染具有相似的临床症状且传统的检测方法费时，难以及时准确的得到诊断结果。因此，建立一种可同时检测H9亚型AIV、H6亚型AIV和AIV的检测方法，可以快速准确的鉴别AIV和/或H9亚型AIV和/或H6亚型AIV，将为感染人的禽流感亚型的监测提供技术支撑，具有重要的公共卫生意义。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是如何鉴定或辅助鉴定H9亚型禽流感病毒和/或H6亚型禽流感病毒和/或禽流感病毒。为解决上述技术问题，本专利技术首先提供了用于鉴定或辅助鉴定H9亚型禽流感病毒和/或H6亚型禽流感病毒和/或禽流感病毒的引物对组。本专利技术所提供的用于鉴定或辅助鉴定H9亚型禽流感病毒和/或H6亚型禽流感病毒和/或禽流感病毒的引物对组，可由特异引物对甲、特异引物对乙和特异引物对丙组成。所述特异引物对甲，可由用于扩增特异DNA片段甲的两条引物组成。所述特异DNA片段甲中具有H9亚型禽流感病毒基因组中引物H9-F和引物H9-R组成的引物对的靶序列。所述引物H9-F可为如下a1)或a2)：a1)序列表的序列1所示的单链DNA分子；a2)将序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同功能的单链DNA分子。所述引物H9-R可为如下a3)或a4)：a3)序列表的序列2所示的单链DNA分子；a4)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功能的单链DNA分子。所述特异引物对乙，可由用于扩增特异DNA片段乙的两条引物组成。所述特异DNA片段乙中具有H6亚型禽流感病毒基因组中引物H6-F和引物H6-R组成的引物对的靶序列。所述引物H6-F可为如下b1)或b2)：b1)序列表的序列3所示的单链DNA分子；b2)将序列3经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列3具有相同功能的单链DNA分子。所述引物H9-R可为如下b3)或b4)：b3)序列表的序列4所示的单链DNA分子；b4)将序列4经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列4具有相同功能的单链DNA分子。所述特异引物对丙，可由用于扩增特异DNA片段丙的两条引物组成。所述特异DNA片段丙中具有禽流感病毒基因组中引物M-F和引物M-R组成的引物对的靶序列。所述引物M-F可为如下B1)或B2)：B1)序列表的序列5所示的单链DNA分子；B2)将序列5经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列5具有相同功能的单链DNA分子。所述引物M-R可为如下B3)或B4)：B3)序列表的序列6所示的单链DNA分子；B4)将序列6经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列6具有相同功能的单链DNA分子。上述引物对组中，所述特异引物对甲可由所述引物H9-F和所述引物H9-R组成。所述特异引物对乙可由所述引物H6-F和所述引物H6-R组成。所述特异引物对丙可由所述引物M-F和所述引物M-R组成。上述引物对组中，所述引物H9-F、所述引物H9-R、所述引物H6-F、所述引物H6-R、所述引物M-F和所述引物M-R的摩尔比具体可为5:5:8:8:5:5。上述任一所述引物对组的应用，可为如下c1)或c2)或c3)或c4)或c5)或c6)或c7)：c1)制备用于鉴定或辅助鉴定H9亚型禽流感病毒和/或H6亚型禽流感病毒和/或禽流感病毒的试剂盒；c2)鉴定或辅助鉴定H9亚型禽流感病毒和/或H6亚型禽流感病毒和/或禽流感病毒；c3)鉴定或辅助鉴定待测病毒是否为候选的H9亚型禽流感病毒、候选的H6亚型禽流感病毒或候选的禽流感病毒；c4)制备用于鉴别H9亚型禽流感病毒、H6亚型禽流感病毒和其它禽流感病毒的试剂盒；所述其它禽流感病毒为除H9亚型禽流感病毒和H6亚型禽流感病毒以外的禽流感病毒；c5)鉴别H9亚型禽流感病毒、H6亚型禽流感病毒和其它禽流感病毒；所述其它禽流感病毒为除H9亚型禽流感病毒和H6亚型禽流感病毒以外的禽流感病毒；c6)制备用于检测待测样本中是否含有H9亚型禽流感病毒和/或H6亚型禽流感病毒和/或禽流感病毒的试剂盒；c7)检测待测样本中是否含有H9亚型禽流感病毒和/或H6亚型禽流感病毒和/或禽流感病毒。含有上述任一所述引物对组的试剂盒也属于本专利技术的保护范围；含有上述任一所述引物对组的试剂盒的功能可为如下c2)或c3)或c5)或c7)：c2)鉴定或辅助鉴定H9亚型禽流感病毒和/或H6亚型禽流感病毒和/或禽流感病毒；c3)鉴定或辅助鉴定待测病毒是否为候选的H9亚型禽流感病毒、候选的H6亚型禽流感病毒或候选的禽流感病毒；c5)鉴别H9亚型禽流感病毒、H6亚型禽流感病毒和其它禽流感病毒；所述其它禽流感病毒为除H9亚型禽流感病毒和H6亚型禽流感病毒以外的禽流感病毒；c7)检测待测样本中是否含有H9亚型禽流感病毒和/或H6亚型禽流感病毒和/或禽流感病毒。含有上述任一所述引物对组的试剂盒的制备方法也属于本专利技术的保护范围；含有上述任一所述引物对组的试剂盒的制备方法，具体可为如下(Ⅰ)或(Ⅱ)：(Ⅰ本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于鉴定或辅助鉴定H9亚型禽流感病毒和/或H6亚型禽流感病毒和/或禽流感病毒的引物对组，由特异引物对甲、特异引物对乙和特异引物对丙组成；所述特异引物对甲，由用于扩增特异DNA片段甲的两条引物组成；所述特异DNA片段甲中具有H9亚型禽流感病毒基因组中引物H9‑F和引物H9‑R组成的引物对的靶序列；所述引物H9‑F为如下a1)或a2)：a1)序列表的序列1所示的单链DNA分子；a2)将序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同功能的单链DNA分子；所述引物H9‑R为如下a3)或a4)：a3)序列表的序列2所示的单链DNA分子；a4)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功能的单链DNA分子；所述特异引物对乙，由用于扩增特异DNA片段乙的两条引物组成；所述特异DNA片段乙中具有H6亚型禽流感病毒基因组中引物H6‑F和引物H6‑R组成的引物对的靶序列；所述引物H6‑F为如下b1)或b2)：b1)序列表的序列3所示的单链DNA分子；b2)将序列3经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列3具有相同功能的单链DNA分子；所述引物H9‑R为如下b3)或b4)：b3)序列表的序列4所示的单链DNA分子；b4)将序列4经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列4具有相同功能的单链DNA分子；所述特异引物对丙，由用于扩增特异DNA片段丙的两条引物组成；所述特异DNA片段丙中具有禽流感病毒基因组中引物M‑F和引物M‑R组成的引物对的靶序列；所述引物M‑F为如下B1)或B2)：B1)序列表的序列5所示的单链DNA分子；B2)将序列5经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列5具有相同功能的单链DNA分子；所述引物M‑R为如下B3)或B4)：B3)序列表的序列6所示的单链DNA分子；B4)将序列6经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列6具有相同功能的单链DNA分子。...

【技术特征摘要】
1.用于鉴定或辅助鉴定H9亚型禽流感病毒和/或H6亚型禽流感病毒和/或禽流感病毒的引物对组，由特异引物对甲、特异引物对乙和特异引物对丙组成；所述特异引物对甲，由用于扩增特异DNA片段甲的两条引物组成；所述特异DNA片段甲中具有H9亚型禽流感病毒基因组中引物H9-F和引物H9-R组成的引物对的靶序列；所述引物H9-F为如下a1)或a2)：a1)序列表的序列1所示的单链DNA分子；a2)将序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同功能的单链DNA分子；所述引物H9-R为如下a3)或a4)：a3)序列表的序列2所示的单链DNA分子；a4)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功能的单链DNA分子；所述特异引物对乙，由用于扩增特异DNA片段乙的两条引物组成；所述特异DNA片段乙中具有H6亚型禽流感病毒基因组中引物H6-F和引物H6-R组成的引物对的靶序列；所述引物H6-F为如下b1)或b2)：b1)序列表的序列3所示的单链DNA分子；b2)将序列3经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列3具有相同功能的单链DNA分子；所述引物H9-R为如下b3)或b4)：b3)序列表的序列4所示的单链DNA分子；b4)将序列4经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列4具有相同功能的单链DNA分子；所述特异引物对丙，由用于扩增特异DNA片段丙的两条引物组成；所述特异DNA片段丙中具有禽流感病毒基因组中引物M-F和引物M-R组成的引物对的靶序列；所述引物M-F为如下B1)或B2)：B1)序列表的序列5所示的单链DNA分子；B2)将序列5经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列5具有相同功能的单链DNA分子；所述引物M-R为如下B3)或B4)：B3)序列表的序列6所示的单链DNA分子；B4)将序列6经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列6具有相同功能的单链DNA分子。2.如权利要求1所述的引物对组，其特征在于：所述特异引物对甲由所述引物H9-F和所述引物H9-R组成；所述特异引物对乙由所述引物H6-F和所述引物H6-R组成；所述特异引物对丙由所述引物M-F和所述引物M-R组成。3.权利要求1或2所述引物对组的应用，为如下c1)或c2)或c3)或c4)或c5)或c6)或c7)：c1)制备用于鉴定或辅助鉴定H9亚型禽流感病毒和/或H6亚型禽流感病毒和/或禽流感病毒的试剂盒；c2)鉴定或辅助鉴定H9亚型禽流感病毒和/或H6亚型禽流感病毒和/或禽流感病毒；c3)鉴定或辅助鉴定待测病毒是否为候选的H9亚型禽流感病毒、候选的H6亚型禽流感病毒或候选的禽流感病毒；c4)制备用于鉴别H9亚型禽流感病毒、H6亚型禽流感病毒和其它禽流感病毒的试剂盒；所述其它禽流感病毒为除H9亚型禽流感病毒和H6亚型禽流感病毒以外的禽流感病毒；c5)鉴别H9亚型禽流感病毒、H6亚型禽流感病毒和其它禽流感病毒；所述其它禽流感病毒为除H9亚型禽流感病毒和H6亚型禽流感病毒以外的禽流感病毒；c6)制备用于检测待测样本中是否含有H9亚型禽流感病毒和/或H6亚型禽流感病毒和/或禽流感病毒的试剂盒；c7)检测待测样本中是否含有H9亚型禽流感病毒和/或H6亚型禽流感病毒和/或禽流感病毒。4.含有权利要求1或2所述引物对组的试剂盒；所述试剂盒的功能为如下c2)或c3)或c5)或c7)：c2)鉴定或辅助鉴定H9亚型禽流感病毒和/或H6亚型禽流感病毒和/或禽流感病毒；c3)鉴定或辅助鉴定待测病毒是否为候选的H9亚型禽流感病毒、候选的H6亚型禽流感病毒或候选的禽流感病毒；c5)鉴别H9亚型禽流感病毒、H6亚型禽流感病毒和其它禽流感病毒；所述其它禽流感病毒为除H9亚型禽流感病毒和H6亚型禽流感病毒以外的禽流感病毒；c7)检测待测样本中是否含有H9亚型禽流感病毒和/或H6亚型禽流感病毒和/或禽流感病毒。5.权利要求4所述试剂盒的制备方法，为如下(Ⅰ)或(Ⅱ)：(Ⅰ)权利要求1或2所述引物对组中各引物对的各条引物分别单独包装；(Ⅱ)权利要求1或2所述引物对组中各引物对的各条引物按比例混合在一起。6.一种鉴定待测RNA病毒是否为候选的H9亚型禽流感病毒、H6亚型禽流感病毒或禽流感病毒的方法，包括如下步骤q1)或q2)：q1)提取待测RNA病毒的RNA，采用权利要求1或2所述引物对组进行RT-PCR扩增，得到RT-PCR扩增产物，然后进行如下判断：如果所述RT-PCR扩增产物中同时含有序列表中序列7自5′末端起第1368至1666位所示的DNA区段和序列表中序列9自5′末端起第268至934位所示的DNA区段，则所述待测RNA病毒为或候选为H9亚型禽流感病毒；如果所述RT-PCR扩增产物中同时含有序列表中序列8自5′末端起第583至1060位所示的DNA区段和序列表中序列9自5′末端起第268至934位所示的DNA区段，则所述待测RNA病毒为或候选为H6亚型禽流感病毒；如果所述RT-PCR扩增产物中含有序列表中序列9自5′末端起第268至934位所示的DNA区段，则所述待测RNA病毒为或候选为禽流感病毒，且不为H9亚型禽流感病毒或H6亚型禽流感病毒；如果所述RT-PCR扩增产物中不含有序列表中序列7自5′末端起第1368至1666位所示的DNA区段，且不含有序列表中序列8自5′末端起第583至1060位所示的DNA区段和序列表中序列9自5′末端起第268至934位所示的DNA区段，则所述待测RNA病毒不为或候选不为H9亚型禽流感病毒、H6亚型禽流感病毒或禽流感病毒；q2)检测待测RNA病毒的cDNA中是否含有序列表中序列7自5′末端起第1368至1666位所示的DNA区段、序列表中序列8自5′末端起第583至1060位所示的DNA区段或序列表中序列9自5′末端起第268至934位所示的DNA区段，然后进行如下判断：如果所述cDNA中同时含有序列表中序列7自5′末端起第1368至1666位所示的DNA区段和序列表中序列9自5′末端起第268至934位所示的DNA区段，则所述待测RNA病毒为或候选为H9亚型禽流感病毒；如果所述cDNA中同时含有序列表中序列8自5′末端起第583至1060位所示的DNA区段和序列表中序列9自5′末端起第268至934位所示的DNA区段，则所述待测RNA病毒为或候选为H6亚型禽流感病毒；如果所述cDNA中仅含有序列表中序列9自5′末端起第268至934位所示的DNA区段，则所述待测RNA病毒为或候选为禽流感病毒，且不为H9亚型禽流感病毒或H6亚型禽流感病毒；如果所述cDNA中不含有序列表中序列7自5′末端起第1368至1666位所示的DNA区段，且不含有序列表中序列8自5′末端起第583至1060位所示的DNA区段和序列表中序列9自5′末端起第268至934位所示的DNA区段，则所述待测RNA病毒不为或候选不为H9亚型禽流感病毒、H6亚型禽流感病毒或禽流感病毒。7.一种鉴别H9亚型禽流感病毒、H6亚型禽流感病毒和禽流感病毒的方法，包括如下步骤s1)或s2)：s1)提取待测病毒的RNA，采用权利要求1或2所述引物对组进行RT-PCR扩增，得到RT-PCR扩增产物，然后进行如下判断：如果所述RT-PCR扩增产物中同时含有序列表中序列7自5′末端起第1368至1666位所示的DNA区段和序列表中序列9自5′末端起第268至934位所示的DNA区段，则所述待测病毒为H9亚型禽流感病毒；如果所述RT-PCR扩增产物中...

【专利技术属性】
技术研发人员：谢芝勋，李丹，李孟，谢志勤，罗思思，谢丽基，黄莉，范晴，黄娇玲，
申请(专利权)人：广西壮族自治区兽医研究所，
类型：发明
国别省市：广西;45