本发明专利技术提供了一种猪圆环病毒2型的PCR检测方法、所用引物及检测试剂盒，所述PCR检测方法操作简单、技术要求低，适合于临床检测。所述PCR检测方法，包括以下步骤：（1）以样品中提取的DNA为模板进行PCR扩增，其中PCR扩增的引物序列为：上游5‑CGTTGGAATGGTACTCCTC‑3；下游5‑TATGGAAATTCAGGGCATG‑3；（2）对扩增产物进行电泳；（3）分析、判定结果，样品出现153bp扩增条带，且阴性对照无相应的扩增条带时，结果为阳性。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种猪圆环病毒2型的PCR检测方法、所用引物及检测试剂盒。
技术介绍
猪圆环病毒（PCV）属于圆环病毒科，圆环病毒属。是迄今为止发现的最小的单股环状DNA病毒，对外界环境有很强的抵抗力，不易被灭活。根据其抗原性的不同，可将其分为不具致病性的1型（PCV1）和具致病性的2型（PCV2），其基因的同源性较高。PCV2的危害主要是侵害机体的免疫系统，使机体的抵抗力遭到破坏，在机体遭受其他病原侵害时抵抗力下降，引起并发或继发感染。PCV2常与猪细小病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪肺炎支原体、猪链球菌等协同作用引起发病。引起的疾病有：断奶仔猪多系统衰弱综合症（PMWS）、猪皮炎和肾病综合症（PDNS）、繁殖与呼吸综合征、渗出性皮炎等疾病。自1997年加拿大报道该病以来，世界上大多数国家和地区对该病均有报道，说明PCV2呈世界性分布，PCV2的发生和蔓延给全世界的养猪业带来了巨大的经济损失。由于目前尚无针对该病的有效预防和控制措施，且该病常以亚临床感染的形式存在，所以做好该病的诊断对该病的监控尤为重要。目前对PCV2的诊断方法较多，除了有传统的病毒分离、免疫荧光法、ELISA等方法以外，还有实时荧光PCR等，与这些方法相比，普通PCR操作简单，技术要求较低，更适合于临床检测或流行病学调查。
技术实现思路
专利技术目的本专利技术的目的是提供一种猪圆环病毒2型的PCR检测方法，操作简单、技术要求低，适合于临床检测。本专利技术的另一个目的是提供用于所述猪圆环病毒2型的PCR检测方法的引物。本专利技术的另一个目的是提供与上述检测方法相应的检测试剂盒。专利技术概述根据本专利技术的第一方面，提供了一种猪圆环病毒2型的PCR检测方法，包括以下步骤：（1）以样品中提取的DNA为模板进行PCR扩增，其中PCR扩增的引物序列为：上游 5-CGTTGGAATGGTACTCCTC-3；下游5- TATGGAAATTCAGGGCATG-3；（2）对扩增产物进行电泳；（3）分析、判定结果，样品出现153bp扩增条带，且阴性对照无相应的扩增条带时，结果为阳性。优选的，PCR扩增的条件及程序为：95℃预变性5min; 94℃变性30s，48-59℃退火30s，72℃延伸30s，共41个循环，最后72℃延伸6min。进一步优选的，PCR扩增的条件及程序为：95℃预变性5min; 94℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸30s，共41个循环，最后72℃延伸6min。优选的，PCR反应体系为：PCR缓冲液；MgCl2终浓度2.5mmol/L；dNTP 终浓度0.2mmol/L；TaqDNA聚合酶1unit；上下游引物终浓度均为0.5μmol/l；模板2.0μl；加ddH2O至终体积50 μl。其中，TaqDNA聚合酶的终浓度为本领域常规参数，引物及模板的终浓度可以由本领域技术人员经试验确定，以能获得有效的PCR扩增反应为目标。所述有效的PCR扩增反应是指当DNA模板中含有足量目标DNA序列可以进行PCR扩增反应时，扩增产物的量足以被检出，显示结果为阳性。所述阴性对照可以由本领域技术人员进行选择，优选的，所述PCR检测方法以猪伪狂犬病病毒作为阴性对照。根据本专利技术的第二方面，还提供了用于所述猪圆环病毒2型的PCR检测方法的引物，其序列为：上游 5-CGTTGGAATGGTACTCCTC-3；下游5- TATGGAAATTCAGGGCATG-3。根据本专利技术的第三方面，还提供了一种用于猪圆环病毒2型的PCR检测试剂盒，所述试剂盒包括：PCR缓冲液；引物对，序列为：上游 5-CGTTGGAATGGTACTCCTC-3，下游5- TATGGAAATTCAGGGCATG-3；MgCl2；dNTP；Taq DNA聚合酶；ddH2O；阴性对照；DNA Ladder。优选的，所述阴性对照为猪伪狂犬病病毒。本专利技术所述猪圆环病毒2型的PCR检测方法操作简单，技术要求较低，便于临床检测或流行病学调查，所检测的泰州地区67份疑似PMWS的病料，其中42份表现为阳性，其阳性率可达62.6%。附图说明图1是实施例1的PCR扩增电泳图，其中，M: 100bp DNA Ladder；1、2、3、4：PCV2扩增产物；图2是敏感性试验的PCR扩增电泳图，其中，M：100bp DNA Ladder；1、2、3、4、5、6、7分别代表稀释10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7倍数的PCV2扩增产物。具体实施方式下边结合实施例作具体的说明。1.1主要试剂及仪器基因组DNA快速抽提试剂盒、100bp DNA Ladder、6× DNA Loading Dye、dNTP Mix均为上海生工生物工程有限公司产品；TaqDNA聚合酶为Fermentas产品，型号EP0404，浓度为1u/μl；25mM MgCl2及10×Buffer为Fermentas产品；PCR扩增仪（PTC-200rev）、JS-380A自动凝胶图像分析仪、Mikro200R冷冻高速离心机、DYY-7C型电泳仪、DYCP-31DN琼脂糖水平电泳槽、恒温箱、微量移液器等。1.2引物的设计及合成参照GenBank上发表的PCV2全基因序列JX682407和专利技术人分离鉴定的5株PCV2序列（GenBank登录号:：KC788750、KF039888、KF039889、KF039890、KF039891），设计一对扩增PCV2片段的特异性引物，扩增片段位于826-979bp,长度为153bp，引物的序列为：上游5- CGTTGGAATGGTACTCCTC-3；下游5- TATGGAAATTCAGGGCATG-3。引物的合成由上海生物工程有限公司合成，-20℃冰箱保存备用。1.3 DNA模板的提取采集有PMWS典型症状发病猪的脾脏、淋巴结和肺等病变组织，按照基因组DNA快速抽提试剂盒的说明书操作。提取的DNA模板-20℃保存备用。实施例1以1.3提取的DNA为模板，用上述引物进行扩增，反应体系为：10×Buffer和MgCl2各5μl，2.5mmol/LdNTP 4μl,TaqDNA聚合酶1μl，上下游引物各1μl，模板2.0μl，加ddH2O至终体积50μl，混匀后放入PCR扩增仪中。反应的程序为：95℃预变性5min; 94℃变性30s，采用48-59℃范围内不同温度退火30s，72℃延伸30s，共41个循环，最后72℃延伸6min，发现退火温度为53℃时扩增效果最好。反应结束后，将PCR产物在1.5%琼脂糖上进行电泳，凝胶成像系统进行观察。在约153bp处见一特异性条带，与预期的大小一致。结果如图1（1、2、3、4是在完全相同条件下的四次重复实验的结果，退火温度均为53℃）。将PCR产物按DNA凝胶回收试剂盒的要求进行回收，将回收产物送去生物公司进行测序，测序的结果与GenBank中的PCV2序列进行比对，结果显示扩增的条带为PCV2序列。实施例2 特异性测定以1.3提取的DNA、猪瘟脾淋苗、猪伪狂犬病阳性病料的DNA、猪大肠杆菌的DNA为模板，用上述所设计的PCV2的特异性引物按照实施例1的方法进行扩增，电泳、观察结果。结果显示，所设计的引物仅能扩增出PCV2的DNA片段，约153bp，而本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种猪圆环病毒2型的PCR检测方法，其特征在于，顺序包括以下步骤：（1）以样品中提取的DNA为模板进行PCR扩增，其中PCR扩增的引物序列为：上游 5‑CGTTGGAATGGTACTCCTC‑3；下游5‑ TATGGAAATTCAGGGCATG‑3；（2）对扩增产物进行电泳；（3）分析、判定结果，样品出现153bp扩增条带，且阴性对照无相应的扩增条带时，结果为阳性。
【技术特征摘要】
1.一种猪圆环病毒2型的PCR检测方法，其特征在于，顺序包括以下步骤：（1）以样品中提取的DNA为模板进行PCR扩增，其中PCR扩增的引物序列为：上游 5-CGTTGGAATGGTACTCCTC-3；下游5- TATGGAAATTCAGGGCATG-3；（2）对扩增产物进行电泳；（3）分析、判定结果，样品出现153bp扩增条带，且阴性对照无相应的扩增条带时，结果为阳性。2.如权利要求1所述的PCR检测方法，其特征在于，所述PCR检测方法以猪伪狂犬病病毒作为阴性对照。3. 如权利要求1所述的PCR检测方法，其特征在于，PCR扩增的条件及程序为：95℃预变性5min; 94℃变性30s，48-59℃退火30s，72℃延伸30s，共41个循环，最后72℃延伸6min。4. 如权利要求3所述的PCR检测方法，其特征在于，PCR扩增的条件及程序为：95℃预变性5min; 94℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸30s，共41个循环，最后72℃...
【专利技术属性】
技术研发人员：曹军平，董亚青，郭广富，朱爱萍，
申请(专利权)人：江苏农牧科技职业学院，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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