一种锚定巢式多重PCR富集DNA目标区域的方法和试剂盒技术

本发明专利技术公开了一种锚定巢式多重PCR富集DNA目标区域的方法和试剂盒，该方法包括：将DNA进行末端修复和接头序列的连接，其中接头序列包括互补的长序列和短序列，长序列在靠近连接端处与短序列互补，其它部分中包含一段标签序列；对连接产物进行第一轮多重PCR反应，其中上游引物为其至少一部分与标签序列相同的锚定引物，下游引物包括多条特异性结合到目标区域上的序列；对第一轮多重PCR反应得到的产物进行第二轮多重PCR反应，其中上游引物为锚定引物，下游引物包括多条5’-端具有测序引物序列、3’-端特异性结合到目标区域上的序列，最后得到目标区域文库。本发明专利技术的方法具有快速、低成本和高通量的特点。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及DNA的目标区域富集
，尤其涉及一种锚定巢式多重PCR富集DNA目标区域的方法和试剂盒。
技术介绍
随着DNA测序技术的发展，高通量测序技术已被广泛地应用于生命科学研究的各个领域。尽管随着测序技术的不断更新与普及，测序技术的成本也越来越低，但全基因组测序技术本身的花费还是很昂贵。一个较好的解决这一问题的方案是将感兴趣的目标区域富集出来后再进行高通量测序。传统的序列捕获技术，通常是将高通量测序文库构建好后，利用探针进行目标区域的文库富集再测序。除此之外Life Tech公司基于多重PCR技术开发了一种称为Ampliseq的试剂盒，可以通过多重PCR的过程实现目标区域的富集，从而大大缩减了杂交捕获这个耗时的操作过程，可以称为区域捕获技术的一项革新。但是Ampliseq对于细胞游离DNA的目标区域富集却无能为力，因为细胞游离DNA具有片段小的特点，其长度甚至已经小于Ampliseq试剂盒PCR产物的长度；除此之外，基于Ampliseq的区域捕获技术只有在PCR后才能够实现样本之间的混合建库，这是一个比较耗时的过程。
技术实现思路
本专利技术提供一种快速、低成本、高通量的锚定巢式多重PCR富集DNA目标区域的方法和试剂盒，能够实现包括细胞游离DNA的目标区域在内的目标区域富集。根据本专利技术的第一方面，本专利技术提供一种锚定巢式多重PCR富集DNA目标区域的方法，该方法包括：将待目标区域富集的DNA进行末端修复和接头序列的连接，其中上述接头序列包括互补的长序列和短序列，上述长序列在靠近连接端处与上述短序列互补，上述长序列的其它部分中包含一段标签序列；对连接上述接头序列的产物进行第一轮多重PCR反应，其中上游引物为锚定引物，下游引物为多重PCR引物组一，上述锚定引物的至少一部分与上述标签序列相同，上述多重PCR引物组一包括多条特异性结合到上述目标区域上的
序列；对上述第一轮多重PCR反应得到的产物进行第二轮多重PCR反应，其中上游引物为上述锚定引物，下游引物为多重PCR引物组二，该多重PCR引物组二包括多条5’-端具有测序引物序列、3’-端特异性结合到上述目标区域上的序列，最后得到两端分别具有上述标签序列和上述测序引物序列的目标区域文库。作为本专利技术的进一步改进的方案，上述多重PCR引物组一的序列与上述多重PCR引物组二的特异性结合到上述目标区域上的序列相同。作为本专利技术的进一步改进的方案，上述标签序列为5-10个碱基的序列，并且上述标签序列在不同样本间为不同序列。作为本专利技术的进一步改进的方案，上述末端修复后的DNA两端带有突出的A碱基，与上述接头序列的突出的T碱基形成粘末端连接。作为本专利技术的更进一步改进的方案，上述接头序列的长序列的3’-端具有上述T碱基、5’-端具有上述标签序列，上述短序列与上述长序列在靠近上述T碱基处互补。根据本专利技术的第二方面，本专利技术提供一种锚定巢式多重PCR富集DNA目标区域的试剂盒，该试剂盒包括如下组成部分：接头序列，该接头序列包括互补的长序列和短序列，上述长序列在靠近连接端处与上述短序列互补，上述长序列的其它部分中包含一段标签序列，上述接头序列用于连接到末端修复后的待目标区域富集的DNA两端；锚定引物，该锚定引物的至少一部分与上述标签序列相同，用于作为第一轮多重PCR反应和第二轮多重PCR反应的上游引物；多重PCR引物组一，该多重PCR引物组一包括多条特异性结合到上述目标区域上的序列，用于作为第一轮多重PCR反应的下游引物；多重PCR引物组二，该多重PCR引物组二包括多条5’-端具有测序引物序列、3’-端特异性结合到上述目标区域上的序列，用于作为第二轮多重PCR反应的下游引物。作为本专利技术的进一步改进的方案，上述多重PCR引物组一的序列与上述多重PCR引物组二的特异性结合到上述目标区域上的序列相同。作为本专利技术的进一步改进的方案，上述标签序列为5-10个碱基的序列，并且上述标签序列在不同样本间为不同序列。作为本专利技术的进一步改进的方案，上述接头序列具有突出的T碱基，与上
述末端修复后的DNA两端的突出的A碱基形成粘末端连接。作为本专利技术的更进一步改进的方案，上述接头序列的长序列的3’-端具有上述T碱基、5’-端具有上述标签序列，上述短序列与上述长序列在靠近上述T碱基处互补。本专利技术的方法和试剂盒采用锚定巢式多重PCR富集技术，大大缩短了杂交捕获带来的时间和成本的浪费，从而提升了目标区域富集技术的操作通量；将连接有标签序列的产物进行目标区域的锚定巢式多重指数扩增反应，实现细胞游离DNA这种短片段分子的区域捕获；通过对不同样本间进行不同标签序列的标记，减少建库的成本。附图说明图1为本专利技术一个实施方案的锚定巢式多重PCR富集DNA目标区域的方法原理流程示意图；图2为本专利技术一个实施例的最终扩增后产物纯化后进行Agilent 2100检测结果图。具体实施方式下面通过具体实施方式结合附图对本专利技术作进一步详细说明。本专利技术一个实施方案的锚定巢式多重PCR富集DNA目标区域的方法，包括：将待目标区域富集的DNA进行末端修复和接头序列的连接，其中上述接头序列包括互补的长序列和短序列，上述长序列在靠近连接端处与上述短序列互补，上述长序列的其它部分中包含一段标签序列；对连接上述接头序列的产物进行第一轮多重PCR反应，其中上游引物为锚定引物，下游引物为多重PCR引物组一，上述锚定引物的至少一部分与上述标签序列相同，上述多重PCR引物组一包括多条特异性结合到上述目标区域上的序列；对上述第一轮多重PCR反应得到的产物进行第二轮多重PCR反应，其中上游引物为上述锚定引物，下游引物为多重PCR引物组二，该多重PCR引物组二包括多条5’-端具有测序引物序列、3’-端特异性结合到上述目标区域上的序列，最后得到两端分别具有上述标签序列和上述测序引物序列的目标区域文库。上述方案中，待目标区域富集的DNA是指将要通过本专利技术的上述实施方案的方法进行DNA的目标区域富集的DNA样本，包括任何DNA样本，如基因
组DNA样本、打断的基因组DNA样本和细胞游离DNA等，其中细胞游离DNA比如外周血肿瘤细胞样本DNA等，本专利技术的上述实施方案的方法特别适合于细胞游离DNA的目标区域富集，这是本专利技术显著优于现有的Ampliseq试剂盒的特征之一。上述方案中，末端修复主要是指对DNA进行末端补平等，还可能包括末端加A反应等。DNA与接头序列的连接可以采用平端连接或者黏端连接的方式，比如将补平末端的DNA直接与平末端的接头序列进行平端连接，或者将末端加A反应后带有突出A碱基的DNA与带有突出T碱基的黏末端的接头序列进行黏端连接。本专利技术一个实施例中，基于末端加A反应的易操作性和黏端连接的高效性，而采用黏端连接的方式实现DNA与接头序列的连接。上述方案中，接头序列包括互补的长序列和短序列，所谓长序列和短序列是相对而言的，并没有绝对的长度标准。由于接头序列是双链的，其中一条链较另一条链长，因此分别称为长序列和短序列，其中短序列一般在长序列的一端与其互补，而这一端也就是接头序列与DNA连接的一端，实际上就是平端连接的平端或黏端连接的黏端。上述方案中，长序列的其它部分中包含一段标签序列，是指长序列中除了与短序列互补的那一段本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种锚定巢式多重PCR富集DNA目标区域的方法，其特征在于，所述方法包括：将待目标区域富集的DNA进行末端修复和接头序列的连接，其中所述接头序列包括互补的长序列和短序列，所述长序列在靠近连接端处与所述短序列互补，所述长序列的其它部分中包含一段标签序列；对连接所述接头序列的产物进行第一轮多重PCR反应，其中上游引物为锚定引物，下游引物为多重PCR引物组一，所述锚定引物的至少一部分与所述标签序列相同，所述多重PCR引物组一包括多条特异性结合到所述目标区域上的序列；对所述第一轮多重PCR反应得到的产物进行第二轮多重PCR反应，其中上游引物为所述锚定引物，下游引物为多重PCR引物组二，所述多重PCR引物组二包括多条5’‑端具有测序引物序列、3’‑端特异性结合到所述目标区域上的序列，最后得到两端分别具有所述标签序列和所述测序引物序列的目标区域文库。

【技术特征摘要】
1. 一种锚定巢式多重PCR富集DNA目标区域的方法，其特征在于，所述方法包括：将待目标区域富集的DNA进行末端修复和接头序列的连接，其中所述接头序列包括互补的长序列和短序列，所述长序列在靠近连接端处与所述短序列互补，所述长序列的其它部分中包含一段标签序列；对连接所述接头序列的产物进行第一轮多重PCR反应，其中上游引物为锚定引物，下游引物为多重PCR引物组一，所述锚定引物的至少一部分与所述标签序列相同，所述多重PCR引物组一包括多条特异性结合到所述目标区域上的序列；对所述第一轮多重PCR反应得到的产物进行第二轮多重PCR反应，其中上游引物为所述锚定引物，下游引物为多重PCR引物组二，所述多重PCR引物组二包括多条5’-端具有测序引物序列、3’-端特异性结合到所述目标区域上的序列，最后得到两端分别具有所述标签序列和所述测序引物序列的目标区域文库。2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述多重PCR引物组一的序列与所述多重PCR引物组二的特异性结合到所述目标区域上的序列相同。3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述标签序列为5-10个碱基的序列，并且所述标签序列在不同样本间为不同序列。4. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述末端修复后的DNA两端带有突出的A碱基，与所述接头序列的突出的T碱基形成粘末端连接。5. 根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述接头序列的长序列的3’-端具有所述T碱基、5’-端具有所述标签序列，所述短序列与所述长序...

【专利技术属性】
技术研发人员：郭晶，蒋慧，郭荣荣，耿春雨，叶睿，
申请(专利权)人：深圳华大基因研究院，
类型：发明
国别省市：广东;44