本发明专利技术涉及一种真核生物DNA的Hi‑C高通量测序建库方法，其中，DNA细胞核内环化步骤包括将末端修复后DNA与环化体系混合并在4‑6℃孵育2‑4h后在16‑22℃下孵育4‑6h获得内环化后物料；其中，所述环化体系的组成成分包括：T4连接酶缓冲液、BSA、T4 DNA连接酶以及选自PEG 4000和PEG 6000中的至少一种的聚乙二醇。本发明专利技术所提供的方法能够有效的提高DNA的特性环化效率，获得明显高于传统方法的有效数据率。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物化学领域，具体的，涉及一种真核生物DNA的Hi-C高通量测序建库方法。
技术介绍
染色体构象捕获(Chromosome Conformation Capture，3C)技术是一种研究染色体和蛋白互作和染色体构象的技术，在第二代测序技术的引导下发展出了多个方法，这些方法中的第一个就是发表于2009年的Hi-C技术。在Hi-C技术中，以整个细胞核为研究对象，利用高通量测序技术，结合生物信息学方法，研究全基因组范围内整个染色质DNA在空间位置上的关系；通过对染色质内全部DNA相互作用模式进行捕获，获得高分辨率的染色质三维结构信息。Hi-C技术应用十分广泛，贯穿当今生命科学研究的前沿及热点领域。现有的Hi-C技术对构建3C文库的过程进行了稍许修改。具体的，在接合前，使用生物素标记的核苷酸填充酶切产生的粘性末端。平末端接合后，提取DNA并使用超声波对DNA进行修剪，最后抓取生物素标记了的DNA片段以确保用以后续分析的数据更多的来自真实的交互。将通过第二代测序得到的DNA序列对映射到参考基因组后，如果一对序列对应于不同的n段酶切片段，那么就认为这两个片段之间有n次相互作用，从而能够构建一个全基因组中所有酶切片段之间接合频率的矩阵。利用这个频率矩阵，将基因组组装过程中形成的contig、scaffold进行染色体定位、方向没定位，延长拼接结果，辅助基因组组装，尤其对于获得群体困难无法构建遗传图谱的物种意义重大。基于高通量进行染色体构象捕获的Hi-C技术，是染色体相互作
用研究领域的一个巨大的飞跃。但是距离研究普遍揭示生物学功能的目标还很遥远，Hi-C交互数据包含相当高的随机噪声。由于临近染色体的随机靠近，捕获的信号会湮没那些特征性的比较稳定的染色质位点间的联系，检测获得的有效数据率不高。现有Hi-C高通量测序的上述缺陷限制了该技术在促进功能基因组研究中的应用，因此有必要对该技术进行改进从而提供一种数据率高、适用性广的新的Hi-C高通量测序建库方法。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有的Hi-C高通量测序建库方法中存在的上述缺陷，提供一种有效数据率高、适用性广的Hi-C高通量测序建库方法。为达到以上目的，本专利技术提供了一种真核生物DNA的Hi-C高通量测序建库方法，所述方法包括以下步骤：首先对样品进行甲醛交联获得交联后的物料，对所述交联后物料进行内切酶酶切获得酶切后物料，用生物素标记的碱基对所述酶切后物料进行末端修复，获得末端修复后DNA，对所述末端修复后DNA进行DNA细胞核内环化获得内环化后物料，再对所述内环化后物料进行解交联和纯化获得DNA测序文库。其中DNA细胞核内环化步骤包括将末端修复后DNA与环化体系混合并在4-6℃孵育2-4h后在16-22℃下孵育4-6h获得内环化后物料；为了进一步提高DNA的特异性环化效率，提高Hi-C文库的有效数据率，优选将末端修复后DNA与环化体系混合并在4℃孵育2h后在22℃下孵育4h获得内环化后物料。内环化的目的是使得具有相互作用的DNA片段之间发生环化。以确保后续测序和分析过程中确定相互作用的DNA的位置。本专利技术对于末端修复后DNA与环化体系的混合比例没有特别的限制，只要能够使得所述DNA能够实现充分的内环化即可。环化过程中，为了
避免染色体间的非特异连接，可以采用较大的连接体系，一般的相对于1g的植物叶片，环化体的用量可以为6ml-8ml。其中，所述环化体系的组成成分包括：T4连接酶缓冲液、BSA、T4 DNA连接酶以及选自PEG 4000和PEG 6000中的至少一种的聚乙二醇。可选的，所述环化体系包括以下用量的各组分：和水，水的用量使得所述环化体系的总量为7ml。在本专利技术的一种特别优选的实施方式中，所述环化体系包括以下用量的各组分：和水，水的用量使得所述环化体系的总量为7ml。可选的，相对于1g样品，环化体系的用量为6-8ml。其中，所述T4连接酶缓冲液中的组成成分可以为：50mMTris-HCl(pH 7.5 25℃)，10mM MgCl2，10mM DTT，1mM ATP，所述T4连接酶为购买的商品化产品，例如可以为NEB公司的T4连接酶，Thermo公司的T4DNA连接酶。本专利技术中进行内环化的过程中，可以直接将末端修复后DNA与环化体系进行孵育，现有技术中一般预先用SDS和Triton X-100处理末端修复后DNA。本专利技术所提供的方法省略了上述步骤，核内环化使得染色体间交互数据的比例显著降低，减少染色质交互数据的噪
声，同时可以消除限制性片段长度偏好性。所述环化步骤优选在分子杂交炉中进行，杂交炉可使DNA和连接酶充分反应，从而提高连接效率。可选的，所述样品为植物组织、动物组织或白细胞。当样品为植物组织时，优选预先对植物组织进行液氮研磨。优选的，所述样品为水稻叶片或人血液白细胞。本专利技术中所述甲醛交联步骤的目的是保存细胞核内蛋白与DNA、DNA与DNA之间的相互作用关系，维持细胞内的3D结构。当所述样品为植物组织或动物组织时，甲醛交联可以按照以下步骤进行：在15-25℃下将样品与交联体系混合后在15-25℃下孵育10-40min进行甲醛交联，孵育结束后加入甘氨酸至终浓度为0.1M-0.2M，在真空下孵育4-6min后用液氮研磨成粉末获得组织样品；其中，所述交联体系为以NIB缓冲液(核分离缓冲液)为基本缓冲液含有终浓度为0.1％-0.2％的巯基乙醇和1％-2％甲醛。在本专利技术的一种具体的实施方式中，在1g样品中加入10-20ml提前预冷的(2-6℃)NIB缓冲液(在使用前加入15μl的巯基乙醇)和1-2ml的36％甲醛溶液，室温条件下，反应10-40min。添加1-2ml2M的甘氨酸，并在真空条件下反应4-6min，所有样品用超纯水清洗2-5次(3000rpm离心15-25min)，收集沉淀并研磨成粉末获得组织样品。本专利技术所提供的方法还包括细胞核提取步骤：将1g所述组织样品置于8-12ml预冷的(2-6℃)含有蛋白酶抑制剂的NIB缓冲液中，并在冰上缓慢震荡10-20min，利用孔径为22-25微米的滤膜过滤两次悬浮液，4℃下3000g离心10-20min，收集沉淀，沉淀用8-12ml含有蛋白酶抑制剂的NIB缓冲液重悬后在4℃1900g离心4-6min，收集沉淀，再用1ml含有蛋白酶抑制剂的NIB缓冲液重悬沉淀后在4℃1900g离心5min，收集细胞核；其中，含有蛋白酶抑制剂的NIB缓冲液中蛋白酶抑制剂的浓度为0.1mM-0.2mM。当所述样品为白细胞时，甲醛交联的步骤包括：PBS重悬收集的白细胞，加入甲醛至终浓度为2％，15-25℃下颠倒混匀8-12min，加入甘氨酸至终浓度为0.1M-0.2M，孵育2-3min；3000rpm离心15-25min，收集沉淀；用2-6℃的PBS重悬沉淀一次，离心去上清，加入2-6℃的含蛋白酶抑制剂的裂解缓冲液重悬细胞，2-6℃孵育18-22min后5000rpm离心4-6min，弃去上清。可选的，所述方法还包括对所述交联后物料进行除蛋白孵育，所述除蛋白孵育的步骤包括：将所述交联后物料与SDS溶液接触混合获得SDS终浓度为0.3％的除蛋白体系，在37℃下孵育0.8-1.2h，孵育本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种真核生物DNA的Hi‑C高通量测序建库方法，其特征在于，DNA细胞核内环化步骤包括将末端修复后DNA与环化体系混合并在4‑6℃孵育2‑4h后在16‑22℃下孵育4‑6h获得内环化后物料；其中，所述环化体系的组成成分包括：T4连接酶缓冲液、BSA、T4DNA连接酶以及选自PEG 4000和PEG 6000中的至少一种的聚乙二醇。
【技术特征摘要】
1.一种真核生物DNA的Hi-C高通量测序建库方法，其特征在于，DNA细胞核内环化步骤包括将末端修复后DNA与环化体系混合并在4-6℃孵育2-4h后在16-22℃下孵育4-6h获得内环化后物料；其中，所述环化体系的组成成分包括：T4连接酶缓冲液、BSA、T4DNA连接酶以及选自PEG 4000和PEG 6000中的至少一种的聚乙二醇。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述环化体系包括以下用量的各组分：3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：首先对样品进行甲醛交联获得交联后的物料，对所述交联后物料进行内切酶酶切获得酶切后物料，用生物素标记的碱基对所述酶切后物料进行末端修复，获得末端修复后DNA，对所述末端修复后DNA进行DNA细胞核内环化获得内环化后物料，再对所述内环化后物料进行解交联和纯化获得DNA测序文库。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，末端修复步骤包括将所述酶切后物料与末端修复体系在37℃下接触孵育45-60min，末端修复体系包括：1μl 10mM dATP，1μl 10mM dGTP、1μl 10mMdTTP、1μl 10mM dCTP、18.4μl-25μl 0.4mM生物素-14和30UKlenow聚合酶。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述方法还包括对所述交联后物料进行除蛋白孵育，所述除蛋白孵育的步骤包括：
\t将所述交联后物料与SDS溶液接触混合获得SDS终浓度为0.3％的除蛋白体系，在37℃下孵育0.8-1.2h，孵育结束后加Triton X-100至终浓度为2％，37℃震荡温浴0.8-1.2h。6.根据权利要求1或5所述的方法，其特征在于，所述样品为植物组织、动物组织或白细胞。7.根据权利要求6所述的方法，其特征...
【专利技术属性】
技术研发人员：郑洪坤，刘慧，宋军，郭艳，
申请(专利权)人：北京百迈客生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11
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