一种检测纯黄丝衣霉菌的试剂、实时荧光PCR试剂盒和检测方法技术

本发明专利技术公开了一种检测纯黄丝衣霉菌(Byssochlamys fulva)的试剂、实时荧光PCR试剂盒及检测方法。该试剂包括：上游引物、下游引物、荧光探针，上游引物、下游引物和荧光探针序列如下：上游引物：5′‑TTGGAAGGTCTATGAGATGAGGAAT‑3′，下游引物：5′‑GCGGAGCGTCTTATTGCAAT‑3′，荧光探针：5′‑TAM‑CAACTTAGCTACAATGGCACCTCCGACCT‑BHQ2‑3′；试剂盒主要包括上游引物、下游引物、荧光探针、PCR缓冲溶液、dNTP、DNA聚合酶和MgCl2；其检测方法包括：基因组DNA的提取、实时荧光PCR检测体系及实时荧光PCR检测。本发明专利技术的有益效果主要体现在：能够准确的从待测样品中检测出纯黄丝衣霉菌，具有特异性强、灵敏度高，还能实时直观地监测PCR扩增过程等优点。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种检测纯黄丝衣霉菌的试剂、实时荧光PCR试剂盒和检测方法，属于生物

技术介绍
纯黄丝衣霉菌(Byssochlamysfulva)是果汁生产过程中易污染的耐热霉菌之一，其抗热力比其他霉菌要强得多，在85℃下经30分钟或87.7℃下经10分钟还能生存。纯黄丝衣霉菌能在氧气不足的环境中生长，还能分解食品中的脂肪、蛋白质、碳水化合物等，有强烈破坏果胶质的作用，可使果实软化和解体，并且产生二氧化碳气体和有毒有害物质，引起产品变质。被耐热霉菌污染的果汁在贮存过程中易出现腐败变质、分层沉淀、甚至胖听爆裂等现象，出现产品质量问题。纯黄丝衣霉目前主要通过传统的培养、分离和生化方法进行鉴定，整个检测过程周期长，操作繁琐耗时，不能满足企业生产环节产品质量的快速监控，和进出口时果汁产品快速准确检测的需要。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的是提供一种检测纯黄丝衣霉菌(Byssochlamysfulva)的试剂，能够运用于实时荧光PCR检测。为此，本专利技术采用以下技术方案：一种检测纯黄丝衣霉菌(Byssochlamysfulva)的试剂，其特征在于它包括上游引物、下游引物和荧光探针；所述上游引物、下游引物和荧光探针序列如下：上游引物：5′-TTGGAAGGTCTATGAGATGAGGAAT-3′下游引物：5′-GCGGAGCGTCTTATTGCAAT-3′荧光探针：5′-TAM-CAACTTAGCTACAATGGCACCTCCGACCT-BHQ2-3′其中TAM为荧光报告基团，BHQ2为荧光淬灭基团。本专利技术的第二个目的是提供一种检测纯黄丝衣霉菌(Byssochlamysfulva)的实时荧光PCR试剂盒，通过根据纯黄丝衣霉的Betatubulin的部分基因序列设计特定的引物和TaqMan荧光探针，实现实时荧光PCR检测试剂盒的制备，并通过检测试剂盒，能对纯黄丝衣霉菌进行快速、准确、特异的检测。为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：一种检测纯黄丝衣霉菌的实时荧光PCR试剂盒，包括：上游引物、下游引物、荧光探针、PCR缓冲溶液、dNTP、DNA聚合酶和MgCl2，其特征在于所述上游引物、下游引物和荧光探针序列如下：上游引物：5′-TTGGAAGGTCTATGAGATGAGGAAT-3′下游引物：5′-GCGGAGCGTCTTATTGCAAT-3′荧光探针：5′-TAM-CAACTTAGCTACAATGGCACCTCCGACCT-BHQ2-3′其中TAM为荧光报告基团，BHQ2为荧光淬灭基团。本专利技术的关键在于上游引物、下游引物和探针序列的设计及检测方法，试剂盒中其他组成，可按本领域常规进行选择，该试剂盒可用作纯黄丝衣霉菌的定性检测。本专利技术还提供了一种检测纯黄丝衣霉菌的实时荧光PCR方法，包括步骤：（1）提取待测样品DNA，通常采用DNA提取试剂盒。（2）采用上述实时荧光PCR试剂盒，对样本DNA和阴性对照样品，进行目的基因的实时荧光PCR反应，并进行荧光检测；（3）选择TAM荧光检测模式，基线调整取3～15个循环的荧光信号，以阈值线刚好超过正常阴性对照的最高点设定阈值线；若待测样品荧光增长曲线超过阈值线，并呈良好的对数增长，Ct值小于35，则判断为阳性。所述步骤（2）中的阴性对照品，可按本领域常规方法选择，通常选择不含靶基因的非靶菌，即选择非纯黄丝衣霉菌DNA样本，如雪白丝衣霉菌、宛氏拟青霉菌等。所述步骤（3）中的Ct值为每个反应管内的荧光信号达到设定的域值时所经历的循环数。所述实时荧光PCR检测体系终浓度组成如下：DNA模板，1～102ng/μL；PCR反应缓冲液，1×；上游引物，0.2～0.4μmol/L；下游引物，0.2～0.4μmol/L；探针，0.2～0.4μmol/L；dNTP，0.2～0.4mmol/L；DNA聚合酶，1～3U/反应；MgCl2，2.0～3.5mmol/L；ROX染料，0.05～0.8μmol/L；溶剂为无菌超纯水。所述PCR缓冲溶液为10×PCR（Mg2+free）缓冲溶液，其反应体系中终浓度为1×，缓冲溶液的组成参见Takara公司的10×PCRBuffer（Mg2+free），Code：A6901A。所述PCR缓冲溶液在PCR反应体系中终浓度为1×。实际使用中，通常选用将DNA聚合酶、反应用Buffer、dNTP、Mg2+等试剂预混在一起的PremixType试剂（如TaqMan2×PCRMasterMix，AppliedBiosystems，K00062），进行实验时，PCR反应液的配制简单方便。所述PCR反应条件可为：95℃预变性3min；95℃变性15s，59℃退火40s，40个循环扩增。专利技术建立了利用TaqMan荧光PCR技术检测纯黄丝衣霉菌的方法，经检测模拟果汁污染样本，表明该方法切实可行。本专利技术的一种检测纯黄丝衣霉菌的试剂、实时荧光PCR试剂盒和检测方法，具有快速、准确检测，敏感性高，特异性好的特点；与常规PCR检测技术相比，实时荧光PCR由于探针的应用和采用完全闭管检测等，具有特异性大大提高、避免了交叉污染、降低常规PCR扩增的假阳性率、实时监测PCR扩增等优点。附图说明图1为实时荧光PCR的特异性检测结果图。图2为实时荧光PCR的灵敏度检测结果图。纯黄丝衣霉DNA浓度1-6依次为：7.2×101，7.2×100，7.2×10＿1，7.2×10＿2，7.2×10＿3，7.2×10＿4ng/μL。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术进行进一步描述，但本专利技术的保护范围并不仅限于此：实施例1：特异引物、荧光探针1、材料：PCR反应缓冲液（10×）（Mg2+free）、dNTP、DNA聚合酶、MgCl2均购自Takara公司；ROX染料购自上海位点生物科技有限公司。ABI7300实时荧光PCR仪为美国AppliedBiosystems公司产品。2、引物及探针设计与合成：以纯黄丝衣霉菌Betatubulin基因序列为模板，使用PrimerExpressTM(V3.0，美国ABI公司)软件分析引物和TaqMan探针位点，从中选择最佳组合：上游引物：5′-TTGGAAGGTCTATGAGATGAGGAAT-3′下游引物：5′-GCGGAGCGTCTTATTGCAAT-3′荧光探针：5′-TAM-CAACTTAGCTACAATGGCACCTCCGACCT-BHQ2-3′其中TAM为荧光报告基团，BHQ2为荧光淬灭基团。均由上海英潍捷基生物技术有限公司合成。实施例2：纯黄丝衣霉实时荧光PCR法灵敏度和特异性评价1、菌株检测：用2株纯黄丝衣霉标准株（ATCC24474、ATCC24008）、以及雪白丝衣霉（ATCC22260、ATCC18742）、费氏新萨托菌（ATCC66640、ATCC66641）、宛氏拟青霉（CICC4024、CICC4025）、黑曲霉（ATCC16404）、烟曲霉（ATCC10894）、酿酒酵母（ATCC26603）、宋内志贺菌（ATCC25931）、金黄色葡萄球菌（ATCC6538）、副溶血性弧菌（本实验室分离保存）、大肠埃希氏菌（ATCC25922）等非纯黄丝衣霉菌菌悬液，提取DNA，然后用检测用上下游引物及探针在美国AB本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测纯黄丝衣霉菌(Byssochlamys fulva)的试剂，其特征在于它包括上游引物、下游引物和荧光探针；所述上游引物、下游引物和荧光探针序列如下：上游引物：5′‑TTGGAAGGTCTATGAGATGAGGAAT‑3′下游引物：5′‑GCGGAGCGTCTTATTGCAAT‑3′荧光探针：5′‑TAM‑CAACTTAGCTACAATGGCACCTCCGACCT‑BHQ2‑3′其中TAM为荧光报告基团，BHQ2为荧光淬灭基团。

【技术特征摘要】
1.一种检测纯黄丝衣霉菌(Byssochlamysfulva)的试剂，其特征在于它包括上游引物、下游引物和荧光探针；所述上游引物、下游引物和荧光探针序列如下：上游引物：5′-TTGGAAGGTCTATGAGATGAGGAAT-3′下游引物：5′-GCGGAGCGTCTTATTGCAAT-3′荧光探针：5′-TAM-CAACTTAGCTACAATGGCACCTCCGACCT-BHQ2-3′其中TAM为荧光报告基团，BHQ2为荧光淬灭基团。2.一种检测纯黄丝衣霉菌(Byssochlamysfulva)的实时荧光PCR试剂盒，所述试剂盒主要包括上游引物、下游引物、荧光探针、PCR缓冲溶液、dNTP、DNA聚合酶和MgCl2，其特征在于所述上游引物、下游引物和荧光探针序列如下：上游引物：5′-TTGGAAGGTCTATGAGATGAGGAAT-3′下游引物：5′-GCGGAGCGTCTTATTGCAAT-3′荧光探针：5′-TAM-CAACTTAGCTACAATGGCACCTCCGACCT-BHQ2-3′其中TAM为荧光报告基团，BHQ2为荧光淬灭基团。3.一种检测纯黄丝衣霉菌的实时荧光PCR方法，其特征在于，包括步骤：（1）提取待测样品DNA；（2）采用如权利要求2所述的实时荧光P...

【专利技术属性】
技术研发人员：张慧，姜侃，汪新，陈小珍，
申请(专利权)人：浙江省质量检测科学研究院，
类型：发明
国别省市：浙江;33