一种食品中毒黄素的快速检测方法技术

本发明专利技术开发了一种基于固相萃取‑高效液相色谱法，快速检测食品中毒黄素残留的方法。食品样品采用纯水溶解、超声提取，以固相萃取小柱(HLB)对样品进行净化、实现目标分析物毒黄素的富集，通过体积分数为80％的甲醇水溶液作为洗脱液对固相萃取小柱进行洗脱，并经N2吹干，水溶解定容后得到上机液。该前处理条件实现了检测样品中毒黄素残留时，有效减少了干扰化合物对毒黄素准确定量的影响、消除了溶剂效应对毒黄素色谱行为的不利影响。流动相以甲醇和水梯度洗脱,增强了毒黄素在反相色谱柱中的保留，实现了样品色谱分析时毒黄素与其他干扰物的有效分离，从而达到准确定量分析的目的。该发明专利技术检测成本低，有毒试剂无消耗对环境友好，方法准确性好、灵敏度高、结果重现性好，适用于多种食品中毒黄素残留检测。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及食品安全
，尤其涉及一种食品中毒黄素的快速检测方法。
技术介绍
毒黄素(toxoflavin)(CAS:84-82-2)的结构式为：它是由椰毒假单胞菌酵米面亚种产生的一种可引起食物中毒的细菌毒素。常见的污染食品主要为谷类发酵制品、薯类制品及银耳等。椰毒假单胞菌酵米面亚种食物中毒多发生在夏秋(主要5～8月)阴雨潮湿的季节，因食物储存不当而引发椰毒假单胞菌快速繁殖生长，食用受其污染的食物会引发中毒，表现为上腹不适、恶心、呕吐、头晕及全身无力等症状，严重可出现肝脾肿大、皮下出血、血尿及休克等，死亡率高达40～100％。多年来关于椰毒假单胞菌中毒引发多起死亡的报道较多，最早发现于1953年酵米面引起的食物中毒，后陆续在全国各地均发现有椰毒假单胞菌引起的食物中毒事件。2014年广南“吊浆粑”椰毒假单胞菌食物中毒事件就引发多人死亡，2015年春节辽阳发生酸汤子中毒事件，疑因米酵菌酸和毒黄素中毒致4人死亡。目前，关于毒黄素的检测方法，尚无相应的国家标准或行业标准。近年来国内外关于食品中毒黄素检测技术的研究，也鲜有报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于针对现有检测技术的不足，提供了一种食品中毒黄素的快速检测方法。本专利技术能够检测谷类发酵制品(包括发酵玉米面、糯米粉、吊浆粑、玉米淀粉、醋凉粉等)、银耳及其制品、薯类制品(如马铃薯粉条、甘薯淀粉、山芋淀粉等)等食品中毒黄素残留。本专利技术的目的是通过以下技术方案来实现的：一种食品中毒黄素的快速检测方法，包括以下步骤：(1)样品提取条件：称取20～25g样品和100mL蒸馏水混合后，超声提取/>20min，取提取液，5000r/min离心5min，得到上清液。(2)样品净化：取步骤1获得的上清液5.0mL，过HLB(6cc,200mg)小柱进行净化(上样前，小柱分别用5mL甲醇和5mL水进行活化)；净化后，将小柱用5mL水淋洗，挤干，弃去全部流出液。然后用5.0mL体积分数为80％的甲醇水溶液进行洗脱，得到洗脱液，将洗脱液用N2吹干，再1.0mL纯水定容，涡旋溶解后得到上机液。(3)色谱分析条件：将步骤2获得的上机液经配有DAD检测器的四元低压或二元高压液相色谱系统进行色谱分析，色谱柱：ODS反相色谱柱(例如ODS C18)，250*4.6mm,5μm；流动相为：甲醇与水梯度洗脱，体积比为(0～10min,7：93；10.1～20min，98：2；20.1～27min,7:93)；进样量：20μl；流速：1.0mL/min；柱温：30℃。检测波长：258nm。(4)样品定性分析：根据步骤3色谱分析得到的保留时间及特征光谱图，与标样的保留时间及特征光谱图进行比对，若两者吻合，则表明含有毒黄素。(5)样品定量分析：标样配制：将毒黄素溶于水，配制成浓度分别为0.05，0.1，0.2，0.4，1.0，2.0，5.0，10.0μg/ml系列标准使用液。以标样响应峰面积作为纵坐标，标样浓度为横坐标(μg/ml)，绘制校正曲线。根据步骤3色谱分析获得的响应峰面积，采用外标法，对样品中毒黄素含量进行定量分析。进一步地，所述浓度分别为0.05,0.1，0.2,0.4，1.0,2.0，5.0,10.0μg/ml系列标准使用液的配制方法如下：称取0.0100g毒黄素标准品于10ml容量瓶中，甲醇溶解后，定容至刻度，配制成1.0mg/ml标准母液。放置于-18℃冰箱中，可以保存3个月。使用前，取出放置室温后，取200μL标准母液于10ml容量瓶中，水定容至刻度，摇匀，配制成20.0μg/ml的中间使用液。分别取25μL，50μL，100μL，200μL，500μL，1.0mL中间使用液以及50μL，100μL标准母液于10mL容量瓶中，水定容至刻度，进一步地，所述检测食品为谷类发酵制品(包括发酵玉米面、糯米粉、吊浆粑、玉米淀粉、醋凉粉等)、银耳及其制品、薯类制品(如马铃薯粉条、甘薯淀粉、山芋淀粉等)等。本专利技术的有益效果是，采用一种检测成本低、净化效果及回收率能够满足检测要求的固相萃取技术，通过优化前处理过程中提取条件(提取溶剂及提取时间)和净化富集步骤中洗脱条件，选择80％甲醇水(体积比)作为毒黄素的洗脱液，实现了目标物毒黄素的有效洗脱，减少了强极性杂质成分在色谱分析中对毒黄素的干扰。另外，本专利技术对色谱条件进行了改进，建立了以甲醇和水梯度洗脱为流动相有效实现了样品检测时目标分析物毒黄素与其他干扰组分的
分离。本专利技术在实际检测中，无有毒试剂消耗对环境友好，检测成本低，灵敏度好，易于推广应用，并适用于多种食品样品中毒黄素残留分析。附图说明图1为标样的校正曲线(Y＝142529.9x+12501.41,R2＝0.9998,R＝0.9999)；图2为毒黄素标样色谱图(保留时间为10.785min)；图3为毒黄素光谱图；图4为80％甲醇水溶解毒黄素的色谱图；图5为90％甲醇溶解毒黄素的色谱图；图6为100％甲醇溶解毒黄素的色谱图；图7为发酵玉米面样品色谱图(阴性)；图8为发酵玉米面样品光谱图(对应保留时间为10.637min)；图9为体积分数80％的乙腈水为提取溶剂时的色谱图；图10为体积分数10％甲醇水为提取溶剂时的色谱图(过柱后的流出液a及洗脱液b)；图11为添加水平为0.2mg/kg的发酵玉米面色谱图；图12为添加水平为0.5mg/kg的发酵玉米面色谱图；图13为添加水平为1.5mg/kg的发酵玉米面色谱图；具体实施方式下面结合实施例对本专利技术作进一步说明。实施例1：绘制响应峰面积-毒黄素浓度的校正曲线。(1)称取0.0100g毒黄素标准品于10mL容量瓶中，甲醇溶解后，定容至刻度，配制成1.0mg/mL标准母液。放置于-18℃冰箱中，可以保存3个月。使用前，取出放置室温后，取200μL标准母液于10mL容量瓶中，水定容至刻度，摇匀，配制成20.0μg/ml的中间使用液。分别取25μL，50μL,100μL,200μL，500μL，1.0mL中间使用液以及50μL，100μL标准母液于10ml容量中，水定容至刻度。配制成浓度分别为0.05,0.1，0.2,0.4，1.0,2.0，5.0,10.0μg/ml系列标准使用液。同时，该部分对定容溶液进行了优化，比较了体积分数80％的甲醇水溶液(附图4)、90％甲醇水溶液(附图5)、100％甲醇(附图6)在色谱分析中对毒黄素色谱行为的影响，发现在定容溶液中甲醇体积分数80％以上时，在色谱分析时，毒黄素色谱峰形成两个分叉峰。从结构式分析，毒黄素为中等极性化合物，溶剂效应强，采用强极性水作为定容溶剂可消除毒黄素的溶剂效应从而形成尖锐
的对称色谱峰。由于毒黄素酸性条件下(pH<2时)不稳定，本研究部分在流动相条件及定容溶液中均未采用有机酸。(2)以标样响应峰面积作为纵坐标，标样浓度为横坐标(μg/ml)，绘制校正曲线。如图1所示。保留时间如图2所示，特征光谱图如图3所示。实施例2：本实施例通过以下方法检测发酵玉米面中的毒黄素：(1)样品提取条件：称取20～25g发酵玉米面和100mL蒸馏水混合后，超声提取20min，取提取液，5000r/min离心5min，得到上清液。(2)样品富集本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种食品中毒黄素的快速检测方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)样品提取条件：称取20～25g样品和100mL蒸馏水混合后，超声提取20min，取提取液，5000r/min离心5min，得到上清液。(2)样品净化：取步骤1获得的上清液5.0mL，过HLB(6cc,200mg)小柱进行净化(上样前，小柱分别用5mL甲醇和5mL水进行活化)；净化后，将小柱用5mL水淋洗，挤干，弃去全部流出液。然后用5.0mL体积分数为80％的甲醇水溶液进行洗脱，得到洗脱液，将洗脱液用N2吹干，再1.0mL纯水定容，涡旋溶解后得到上机液。(3)色谱分析条件：将步骤2获得的上机液经配有DAD检测器的四元低压或二元高压液相色谱系统进行色谱分析，色谱柱：ODS反相色谱柱(例如ODS C18)，250*4.6mm,5μm；流动相为：甲醇与水梯度洗脱，体积比为(0～10min,7：93；10.1～20min，98：2；20.1～27min,7:93)；进样量：20μl；流速：1.0mL/min；柱温：30℃。检测波长：258nm。(4)样品定性分析：根据步骤3色谱分析得到的保留时间及特征光谱图，与标样的保留时间及特征光谱图进行比对，若两者吻合，则表明含有毒黄素。(5)样品定量分析：标样配制：将毒黄素溶于水，配制成浓度分别为0.05，0.1，0.2，0.4，1.0，2.0，5.0，10.0μg/ml系列标准使用液。以标样响应峰面积作为纵坐标，标样浓度为横坐标(μg/ml)，绘制校正曲线。根据步骤3色谱分析获得的响应峰面积，采用外标法，对样品中毒黄素含量进行定量分析。...

【技术特征摘要】
1.一种食品中毒黄素的快速检测方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)样品提取条件：称取20～25g样品和100mL蒸馏水混合后，超声提取20min，取提取液，5000r/min离心5min，得到上清液。(2)样品净化：取步骤1获得的上清液5.0mL，过HLB(6cc,200mg)小柱进行净化(上样前，小柱分别用5mL甲醇和5mL水进行活化)；净化后，将小柱用5mL水淋洗，挤干，弃去全部流出液。然后用5.0mL体积分数为80％的甲醇水溶液进行洗脱，得到洗脱液，将洗脱液用N2吹干，再1.0mL纯水定容，涡旋溶解后得到上机液。(3)色谱分析条件：将步骤2获得的上机液经配有DAD检测器的四元低压或二元高压液相色谱系统进行色谱分析，色谱柱：ODS反相色谱柱(例如ODS C18)，250*4.6mm,5μm；流动相为：甲醇与水梯度洗脱，体积比为(0～10min,7：93；10.1～20min，98：2；20.1～27min,7:93)；进样量：20μl；流速：1.0mL/min；柱温：30℃。检测波长：258nm。(4)样品定性分析：根据步骤3色谱分析得到的保留时间及特征光谱图，与标样的保留时间及特征光谱图进行比对，若两者吻合，则表明含有毒黄素。(5)样品定量分析...

【专利技术属性】
技术研发人员：李红艳，翁晨辉，黄海智，沈潇冰，盛华栋，张东雷，张慧，王瑾，
申请(专利权)人：浙江省质量检测科学研究院，
类型：发明
国别省市：浙江;33