一种检测仔猪脐带血中猪细小病毒的实时荧光PCR试剂盒及其用途制造技术

本发明专利技术公开了一种仔猪脐带血中猪细小病毒的实时荧光PCR试剂盒及其用途。该试剂盒是根据猪细小病毒VP2基因而研制的实时荧光PCR试剂盒，包括针对猪细小病毒VP2基因序列设计的Taqman荧光探针及引物，所述引物的序列如SEQ ID NO:1以及SEQ ID NO:2所示，所述荧光探针的序列如SEQ ID NO:3所示。本发明专利技术的试剂盒能够特异性地检测仔猪脐带血中的猪细小病毒，并具有较高的灵敏度，特异性强和重复性优，可以实现大通量样品的检测。并且本发明专利技术的试剂盒检测结果快速高效，不会造成样品交叉污染，同时达到母仔猪同时监测的目的。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及动物病原分子诊断
，特别涉及一种检测仔猪脐带血中猪细小病毒的实时荧光PCR试剂盒及其用途。
技术介绍
猪细小病毒(Porcineparvovirus，PPV)可以引起猪细小病毒病，该病可以引起母猪尤其是初产母猪产弱仔、死胎及流产等繁殖障碍，也有报道称PPV可引起仔猪皮炎、腹泻及呼吸道疾病。该病分布广泛，全世界范围内均可发生。该病一年四季均可发生，但在每年4～10月母猪产仔、交配的季节多发。该病呈地方性流行或者散发，本病发生后，猪场可连续几年不断出现繁殖失败。该病的主要传染对象是青年母猪，尤其是头胎母猪感染性极强，病毒进入胎盘可损害胎盘以及胎儿的很多组织器官，导致死胎、木乃伊胎的发生。目前，PPV较为成熟的实验室诊断方法主要以血清学检测抗体或可通过抗体反应间接检测病毒，主要包括：(1)血凝(HA)：多用于对病毒培养物的检测，依赖于病毒的血凝活性，因此易受病毒传代、保存时限的影响。(2)血凝抑制试验(HI)：该方法具有操作简便，不需要特殊设备等特点，因此国内长期用于抗体的检测。但该方法使用红细胞，需对检测样品做繁杂的处理，虽能进行快速、大量的诊断，但灵敏度低、特异性不强，只能做辅助诊断方法。(3)中和试验(SN)：用于中和抗体的检测，该方法比HI更加敏感，但操作也更为复杂。(4)酶联免疫吸附试验(ELISA)：多用于抗体检测，Hodals等(1988年)、Westenbrink等(1989年)、邱明建等(1989年)分别建立了ELISA方法用于检测PPV抗体，该方法灵敏度高，适合PPV的早期诊断和流行病学调查。在实践中，由于疫苗的使用，很难通过抗体检测区分疫苗免疫与野毒感染，需要检测抗原的ELISA方法。姜永厚(1997年)建立了检测PPV抗原的ELISA方法，比HA敏感、快速。(5)免疫荧光抗体：Rivera等(1986年)应用固相免疫荧光技术快速检测PPV感染胎儿的抗原与抗体，结果发现该技术与ELISA具有一致的高敏感性，免疫荧光技术具有快速、特异、敏感等优点，但在临床应用过程中常受到试验条件的限制。但是血清学检测技术存在以下缺点：(1)对猪群中存在的免疫耐受现象评估较难，相对不能更加有效、直观和高精准反映猪群的抗体水平。(2)血样及组织样本采集需要多人协助，且需要特殊设备，采集过程相对比较费时。而血清学检测技术存在上述缺点的原因在于：①血清学检测方法是抗原和抗体反应，仅检测1次无法准确判断猪群的感染状况和排毒状况；②血清学检测抗体，检测的抗体水平高低无法精确定量检测分析，血清学仅能评价机体体液免疫产生的水平，很难直接评价病原情况；③血清学评估猪群健康度、对无症状带毒和免疫耐受的猪群评估存在技术上的瓶颈；④血清学需要采集前腔静脉血，血样采集相对费力、费时、且需要特殊设备辅助，多人协助。分子诊断技术近年来用于检测动物病原，极大的提高诊断的敏感性与特异性，主要包括：(1)核酸探针：核酸探针技术是一种分子水平的检测技术,特别适用于疾病的早期诊断。核酸探针技术检测的技术含量高，仅适合在实验室应用。(2)聚合酶链式反应(PCR)：PPV属于小细小病毒科细小病毒属，基因组为单链线状负链DNA的分子，是自主复制性的DNA病毒，因此可用PCR的方法来扩增并检测病毒核酸。国内外已有很多PPV的PCR检测方法研究报道，这些方法虽然应用比较广泛，但技术含量要求高或未能形成产品化，只能在专业实验室应用，不适合大面积临床诊断和现场应用。分子诊断技术存在以下缺点：(1)需要复杂的仪器设备：核酸提取仪器、PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统和分析软件。(2)操作复杂操作时间长：需要提取核酸、PCR试剂配置、PCR反应、电泳、凝集成像、分析结果等，做一次病原检测需要近一天时间。(3)结果相对不可靠：非常容易污染，即使是国内权威的实验室检测结果都存在假阳性结果。(4)技术操作要求高：很难在基层推广，猪场配备了设备但是没有人和时间使用。(5)质量控制不到位，难以标准化。分子诊断技术存在上述缺点的原因在于：①普通PCR本身操作较复杂操作时间较长；②普通PCR所用试剂相对成本较低所导致。同时上述检测方法实验室应用较多，临床应用较少。目前的检测多是在规模化猪场出现疑似猪细小病毒病的疫情后，送检患病猪的病料(包括流产或死产胎儿的脑、肺、肝、肾和母猪胎盘)，利用常规PCR方法进行检测，根据检测结果，结合该猪场其他情况给出诊断报告并制定疫病防控计划。一方面由于这种“事后”检测导致诊断结果对猪场疫病防控的指导意义有一定的局限性，无法做到未雨绸缪。另一方面，常规PCR方法操作时间较长，操作过程中容易发生污染。实时荧光定量PCR是在常规PCR技术的基础上发展起来的一种较新的核酸检测技术，具备灵敏度高、快速便捷、抗污染能力强、安全系数好、结果可视化等优点。通过对探针的巧妙设计，可以检测区分单个的核苷酸碱基差异，因此能很好的用于不同类型毒株的差异化检测。猪属于上皮绒毛胎盘，猪胎盘生理正常的结构即血胎屏障，胎盘屏障的存在使正常的脐带血内不存在任何病原和抗体等大分子物质，但在如某些病毒单独或协同感染的情况下，屏障通透性变化导致病原从母体垂直传播至新生个体。PPV病毒颗粒小，且主要引起繁殖障碍相关症状，且鉴于猪的多病毒混合感染非常严重，因此采用从仔猪脐带血中检测PPV来评价及预警猪细小病毒病的发病情况，这种寻找“源头”的检测方法更加科学、直接、有效。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提出一种检测仔猪脐带血中猪细小病毒的实时荧光PCR试剂盒。该试剂盒具有灵敏度高、特异性好、重复性优、检测结果快速客观准确等优点，能同时反映母、仔猪PPV带毒状况，评估母猪疫苗的免疫效果，有益于对猪群PPV感染和免疫情况的早期预警评判，进一步有助于猪场做好该疾病的防控工作。基于上述目的，本专利技术提供了一种检测仔猪脐带血中猪细小病毒的实时荧光PCR试剂盒，包括扩增引物和特异性荧光探针，所述扩增引物和特异性荧光探针的序列如下所示：上游扩增引物PPV-f：5’-GAACAAGAAATATTCAATGTAGTA-3’，其为SEQIDNO:1序列；下游扩增引物PPV-r：5’-TGTGTTATTGGTGTCTAGT-3’，其为SEQIDNO:2序列；特异性荧光探针PPV-p：FAM-5’-CAGCAACCTCACCACCAACC-3’-TAMRA，其为SEQIDNO:3序列，其中FAM为荧光报告基团，TAMRA为荧光淬灭基团。合理的引物和荧光探针设计是成功应用实时荧光PCR技术的关键。引物和探针的特异性对反应有很大影响，如果引物和探针特异性不高，可能在扩增构成中产生非靶标条带，影响检测结果的判定。PPV基因组为单链线状DNA分子，主要有2个开放阅读框(ORF)，5’端的ORF编码3种非结构蛋白NS1、NS2、NS3，3’端ORF编码2种结构蛋白VP1和VP2，VP3是VP2的水解产物。本专利技术对GenBank中公布的PPV和其它宿主的细小病毒毒株基因序列进行对比分析，筛选出PPV病毒基因组中VP2基因的一段基因片段，该基因片段在猪细小病毒中高度保守，大小为123bp，作为本专利技术设计引物的靶片段。专利技术人针对该保守片段设计了多对引物和探针，最终根据扩增效果(扩增效率、灵敏度等)筛选出本本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测仔猪脐带血中猪细小病毒的实时荧光PCR试剂盒，其特征在于，包括扩增引物和特异性荧光探针，所述扩增引物和特异性荧光探针的序列如下所示：上游扩增引物PPV‑f：5’‑GAACAAGAAATATTCAATGTAGTA‑3’，其为SEQ ID NO:1序列；下游扩增引物PPV‑r：5’‑TGTGTTATTGGTGTCTAGT‑3’，其为SEQ ID NO:2序列；特异性荧光探针PPV‑p：FAM‑5’‑CAGCAACCTCACCACCAACC‑3’‑TAMRA，其为SEQ ID NO:3序列，其中FAM为荧光报告基团，TAMRA为荧光淬灭基团。

【技术特征摘要】
1.一种检测仔猪脐带血中猪细小病毒的实时荧光PCR试剂盒，其特征在于，包括扩增引物和特异性荧光探针，所述扩增引物和特异性荧光探针的序列如下所示：上游扩增引物PPV-f：5’-GAACAAGAAATATTCAATGTAGTA-3’，其为SEQIDNO:1序列；下游扩增引物PPV-r：5’-TGTGTTATTGGTGTCTAGT-3’，其为SEQIDNO:2序列；特异性荧光探针PPV-p：FAM-5’-CAGCAACCTCACCACCAACC-3’-TAMRA，其为SEQIDNO:3序列，其中FAM为荧光报告基团，TAMRA为荧光淬灭基团。2.根据权利要求1所述的检测仔猪脐带血中猪细小病毒的实时荧光PCR试剂盒，其特征在于，所述上游扩增引物PPV-f、所述下游扩增引物PPV-r和所述特异性荧光探针PPV-p的摩尔比为2:2:1。3.根据权利要求2所述的检测仔猪脐带血中猪细小病毒的实时荧光PCR试剂盒，其特征在于，所述上游扩增引物PPV-f、所述下游扩增引物PPV-r在所述试剂盒中的终浓度均为0.3～0.6μM，所述特异性荧光探针PPV-p在所述试剂盒中的终浓度为0.15～0.3μM。4.根据权利要求1所述的检测仔猪脐带血中猪细小病毒的实时荧光PCR试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阴性对照、阳性对照、荧光PCR反应液(含酶)、病毒裂解液及说明书。5.根据权利要求4所述的检测仔猪脐带血中猪细小病毒的实时荧光PCR试剂盒，其特征在于，所述阴性对照为无DNA酶的ddH2O，所述阳性对照为含有猪细小病毒VP2基因序列的克隆质粒pEASY-VP2，克隆质粒pEASY-VP2的终浓度为1.0×105copies/μL～1.0×107copies/μL；所述病毒裂解液的成分及配比如下：①盐酸胍4-6M；②十二烷基磺酸钠SDS0.1-0.2％；③吐温201-2％；④乙基苯基聚乙二醇NP401-2％。6.根据权利要求5所述的检测仔猪脐带血中猪细小病毒的实时荧光PCR试剂盒，其特征在于，所述猪细小病毒VP2基因序列的核苷酸序列如SEQID...

【专利技术属性】
技术研发人员：喻正军，李增强，石建，廖娟红，
申请(专利权)人：湖南新南方养殖服务有限公司，
类型：发明
国别省市：湖南;43