本发明专利技术公开了一种呕吐毒素定量检测试剂盒机器使用方法，所述试剂盒包括：①磁分离试剂；②抗试剂；③酶标抗原试剂；④清洗液；⑤校准品、质控品；⑥底物溶液；⑦终止液；其中磁分离试剂为结合有抗异硫氰酸荧光素FITC-DON抗体的磁微粒混悬液；抗试剂为FITC标记的抗DON抗体溶液；酶标抗原试剂为偶联有生物酶的DON溶液；本发明专利技术的具有显著优点：本发明专利技术的呕吐毒素定量检测试剂盒操作简单、快速、灵敏准确；能够适用于日常大规模的食品或饲料中呕吐毒素的样品检测。
【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术公开了一种呕吐毒素定量检测试剂盒机器使用方法，所述试剂盒包括：①磁分离试剂；②抗试剂；③酶标抗原试剂；④清洗液；⑤校准品、质控品；⑥底物溶液；⑦终止液；其中磁分离试剂为结合有抗异硫氰酸荧光素FITC-DON抗体的磁微粒混悬液；抗试剂为FITC标记的抗DON抗体溶液；酶标抗原试剂为偶联有生物酶的DON溶液；本专利技术的具有显著优点：本专利技术的呕吐毒素定量检测试剂盒操作简单、快速、灵敏准确；能够适用于日常大规模的食品或饲料中呕吐毒素的样品检测。【专利说明】
本专利技术涉及生物监测领域，属于生物
，特别是。
技术介绍
呕吐毒素(Vomitoxin),又称脱氧雪腐镰刀菌烯醇(Deoxynivalenol, DON),化学名称为3 α，7 α，I，5 —三羟基草镰孢菌一 9 一烯一 8 —酮，属单端孢霉烯族化合物。，DON具有很高的细胞毒性及免疫抑制性，因此，对人类及动物的健康构成了威胁。在20世纪90年代开始推广的磁微粒分离酶联免疫检测技术是一种结合免疫磁微粒分离技术与酶联免疫检测技术建立的新型酶联免疫检测方法。磁微粒酶联免疫反应在近似液相下进行反应，免疫反应的表面积较ELISA法有更大的提高；另外磁微粒具有超顺磁性，在磁场下具有磁场响应性，更易于固液分离。该方法克服了普通酶联免疫分析(ELISA)分析精密度差、灵敏度差的缺点，反应快速、彻底，具有灵敏度高，特异性高，操作简便，检测用时少和不易受外界因素干扰的优点。现在，还缺少能够快速、高效、高灵敏度检测呕吐毒素的试剂盒，因此想要迅速、高效的检测呕吐毒素依然很困难。【专利技术内容】为解决现有技术的不足，本专利技术的目的在于提供一种呕吐毒素定量检测试剂盒及其制备、操作方法，采用该试剂盒进行呕吐毒素检测具有较高的灵敏度、特异性、操作简便和更短检测时间的优点。为了实现上述目标，本专利技术采用如下的技术方案:一种呕吐毒素定量检测试剂盒，其特征在于，包括:①磁分离试剂；②抗试剂；③酶标抗原试剂；④清洗液；⑤校准品、质控品；⑥底物溶液；⑦终止液；其中磁分离试剂为结合有抗异硫氰酸荧光素FITC-DON抗体的磁微粒混悬液；抗试剂为FITC标记的抗DON抗体溶液；酶标抗原试剂为偶联有生物酶的DON溶液。一种呕吐毒素定量检测试剂盒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤:磁分离试剂的制备:选用IOOmg具有顺磁性、表面带有羧基活性基团的磁分离微粒用0.lmol/L、pH4.5的2-(N-吗啉代)乙磺酸MES溶液IOmL洗涤3次后，磁分离微粒用该溶液ImL重悬；之后加入50-250 μ I浓度为10mg/ml碳二亚胺EDC活化，25°C混匀2小时，加入2mg抗FITC抗体，37°C混合均匀2小时；之后加入ImL浓度为0.0lmol/L PBS缓冲液于37°密闭静置I小时，所述PBS缓冲液为pH7.4的5%牛血清白蛋白BSA ;最后用IOmL0.5%BSA溶液的0.0lmol/L磷酸缓冲溶液PBS缓冲液洗涤磁珠3次，并用该溶液制成磁分离试剂溶液；②抗试剂的制备:将DON单克隆抗体溶液与FITC共价连接；③酶标抗原试剂的制备:所述酶标抗原试剂的制备包括以下成分:D0N-BSA偶联物以及酶标抗原试剂；(I) DON-BSA偶联物的制备:取20mgD0N、lmol马来酸酐以及0.05—0.1mol的4_ 二甲氨基吡啶DMAP，溶于2ml甲苯，80°C搅拌12小时，蒸干溶剂，酸化，萃取，重结晶后得到DON半抗原；将60mg DON 半抗原溶于 9.5mL0.01mol/L、pH5.0 的 PBS 溶液中，加入 12.5mg EDC,再加入Iml溶解了 IOmgDON半抗原的二甲基甲酰胺DMF溶液，25°C搅拌反应2小时，再加入6mgEDC,置于阴暗处搅拌反应12小时，用0.01mol/L PBS透析72小时，每8小时更换I次透析液，即得到DON-BSA偶联物；⑵酶标抗原试剂制备:a.将 5mg DON-BSA 抗原溶于 0.01mol/L ρΗ7.4 的 PBS 溶液中，加入 0.1mol/mL 活化剂2-1minothiolane.HCl溶液20 μ L，20°C放置30分钟后加入甘氨酸终止反应；20°C静置3-5分钟；过柱子除去活化剂，收集蛋白峰；b.将碱性磷酸酶ALP溶于pH8.0的2mmol/L EDTA、20mmol/L三羟甲基氨基甲烷Tris-HCL溶液中，溶度5mg/mL，加入0.10mg/mL巯基活化试剂，室温放置40分钟，过柱子除去活化剂，收集蛋白峰；将a和b溶液按照抗体与碱性磷酸酶分子摩尔比1:1混合，室温放置3小时，然后用凝胶层析柱分离纯化，收集第一峰和第二峰，除去未连接的游离抗体和碱性磷酸酶，将产物保存在4°C，将上述连接物用酶反应物稀释液稀释到5ug/mL，使用0.2 μ m过滤器过滤后4°C保存；其中，酶反应物稀释液配置方法:Trisl2.5g，氯化钠8.5g，叠氮钠lg，加纯化水至600mL,调整pH值至7.5 ;加吐温_201mL，BSAlOg,加纯化水定容至IL ;用0.2 μ m过滤器过滤，于4°C保存；④清洗液的制备:取Trisl2.54g、NaC1325.6g 与吐温 _205g 先溶于 900ml 水中，再取 0.2ml 液体生物防腐剂Proclin-300溶于溶液中，最后将pH调整至7.4并定容至1000ml，完全溶解后用0.2um滤器过滤既得清洗液浓缩液，使用时稀释20倍既得清洗液；⑤校准品与质控品的制备:将DON抗原称重后用标准品缓冲液溶解分装，校准品浓度分别为lng/mL、10ng/mL、40ng/mL、200ng/mL 与 1000ng/mL,质控品溶度为 Ing/mL 与 100ng/mL, 4°C保存；其中，标准品缓冲液的配制:取Tris2.42g、NaC12g, BSA2.5g, Proclin_3001ml 溶解于1000ml纯化水，pH调整至7.4，用0.2 μ m过滤器过滤，4°C保存；⑥底物溶液的制备:取乙醇胺100g，NaC12g，单磷酸酚酞4g，用纯化水配成1000ml，用37%盐酸调pH至8.4,用0.2μηι过滤器过滤,于4°C保存；⑦终止液的制备取NaCll-2g，Na2C0310-15g，EDTA10-15g，用纯化水配制成 1000ml，用 0.2 μ m 过滤器过滤，常温保存。一种呕吐毒素定量检测试剂盒的制备方法，其特征在于，所述选取的100mg具有顺磁性、表面带有羧基活性基团的磁分离微粒的直径为0.1-0.2um。一种呕吐毒素定量检测试剂盒的制备方法，其特征在于，所述FITC抗体为羊抗、鼠抗或兔抗。一种呕吐毒素定量检测试剂盒的制备方法，其特征在于，所述DON单克隆抗体为羊抗、鼠抗或兔抗。一种呕吐毒素定量检测试剂盒的制备方法，其特征在于，所述MES溶液的制备方法为:称取MES19.52g，Trisl.56g, NaC14.24g于IL烧杯中，量取950mL纯化水溶解，调节pH至4.5 ;加纯化水定容到1L，采用孔径0.2 μ m滤膜过滤除菌，4°C保存。一种呕吐毒素定量检测试剂盒的制备方法，其特征在于，所述DON单克隆抗体溶液与FITC共价连接的连接方法为Marsshall法。一种呕本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种呕吐毒素定量检测试剂盒，其特征在于，包括：①磁分离试剂；②抗试剂；③酶标抗原试剂；④清洗液；⑤校准品、质控品；⑥底物溶液；?⑦终止液；其中磁分离试剂为结合有抗异硫氰酸荧光素?呕吐毒素FITC?DON抗体的磁微粒混悬液；抗试剂为FITC标记的抗DON抗体溶液；酶标抗原试剂为偶联有生物酶的DON溶液。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：王毅谦，邵景东，吴福平，郭旸，申进玲，
申请(专利权)人：中华人民共和国张家港出入境检验检疫局，
类型：发明
国别省市：
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