一种细菌快速裂解试剂盒及其检测方法技术

本发明专利技术涉及一种细菌快速裂解试剂盒及其检测方法，可对临床及食品样本中细菌的核酸进行快速提取，提取的核酸可直接用于PCR或荧光PCR检测，也可置于-20℃长期保存。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于体外诊断试剂
，具体涉及一种细菌快速裂解试剂盒及其检测 方法，可对临床及食品样本中细菌的核酸进行快速提取。
技术介绍
感染性疾病是全世界共同面对的不可忽视的公共卫生问题，其发病率也在人类各 种疾病中居首位，其中细菌是引起感染性疾病的一类重要病原体。建立快速有效的细菌检 测方法在感染性疾病的预防、检测以及治疗方面均起着至关重要的作用。目前国内外对细 菌的检测方法主要包括培养法、免疫学检测和核酸检测等。传统培养鉴定法操作比较繁琐， 对操作人员技术水平要求比较高，且检测周期长，一般需要5-7天时间，在时效上不能满足 临床诊断和治疗的需求，因此可能延误对患者的治疗。同样，在传染病疫情爆发时，实验室 仅依赖传统培养方法也不能满足疫情防控的需要。免疫学主要应用抗原抗体特异结合的特 点进行细菌的检测，常见的方法有免疫层析、免疫渗滤、免疫荧光、ELISA等。方法操作简便 快速，但灵敏度不足，通常在l〇5CFU/ml，对一些样本中含量极少的病原微生物会发生漏检， 不能完全满足检测需求。核酸检测操作简便，通常几小时就能得出分析结果，且检测灵敏度 比免疫法更高，因此核酸检测成为快速检测方法的趋势。核酸检测的第一步就是对样本进 行核酸提取。细菌检测的样本大多为临床样本、食品样本或环境样本。这些样本往往细菌含 量较低，核酸提取效率的高低是至关重要的，直接影响到实验的阳性检出率。现在检测机构 用得较多的细菌核酸提取的方法包括Trizol提取法（LifeTechnology),柱提法（Qiagen, Roche)和磁珠法（Chemagen、Thermo、金麦格)。Trizol提取法提取的核酸得率相对较低，且 步骤较为繁杂，整个提取过程耗时1-2小时，直接影响检测效率。柱提法和磁珠法的试剂盒 在一定程度上提高了核酸提取效率，简化了核酸提取的步骤，也提高了提取的速度，但整个 提取过程仍需0. 5-1小时。除了提取时间长，这些提取试剂盒的价格都极为昂贵，每一个样 本的的提取约需30-50元不等。同时对于含抑制物比较强的粪便、牛奶等样本，以及细胞壁 比较厚的革兰氏阳性菌，目前的核酸提取方法提取效果都不理想。因此，临床基因诊断需要 操作简单、快速、价格低廉的样本前处理试剂，尤其对于临床样本量较大的病例，简单快速 的核酸提取显得尤为重要。 现有核酸提取试剂提取临床样本、食品样本中的细菌核酸存在操作时间长、成本 高、提取效率低等问题，本专利技术成功解决了以上问题。本专利技术提出了一种对临床或食品样本 中细菌进行快速裂解的试剂盒及其检测方法，整个提取过程不超过10分钟，既简化核酸提 取过程，同时也大大节约成本，且无需进行纯化便可直接用于扩增。由于本试剂盒具有核酸 得率高、实验操作简单、实验条件简易、成本低等优点，可广泛用于病原微生物检测，流行病 学调查、菌群调查的核酸检测，对细菌高通量筛选尤为适用。
技术实现思路
本专利技术的一个目的在于提供一种细菌快速裂解试剂盒，提取的核酸可直接用于 PCR扩增或荧光PCR检测，也可置于-20 °C长期保存。 为了解决上述任务，本专利技术的具体技术路线为： 1)从各种去污剂着手，筛选裂解细菌能力强的去污剂和最佳配比，以使整个裂解过程 只需5分钟加热便能最大程度地释放细菌样本核酸。 2)在裂解细胞、释放核酸的同时，由于核酸的质量会影响PCR扩增的效果，需采用 防止核酸降解的技术。 3)针对各种复杂的样本类型，如粪便、牛奶、食品等，确定相应的处理方法和检测 步骤，以减少抑制物的干扰，最大程度保障后续的扩增检测。 通过反复的摸索，确定了细菌样本快速裂解试剂盒各组成成分及浓度，该试剂盒 核酸得率高、实验操作简单，无需复杂的实验设备且成本低廉。 本专利技术所提供的细菌快速裂解试剂盒包括：（1)装有细菌裂解液的试剂瓶或管， 和（2)分隔并集中包装这些试剂瓶或管的包装盒，其特征在于细菌裂解液由月桂酰基肌氨 酸钠、二硫苏糖醇、TE(pH7. 4)组成。 本专利技术的另一个优选实施方案是细菌裂解液中月桂酰基肌氨酸钠的最佳浓度为 5g/L。 本专利技术的另一个优选实施方案是细菌裂解液中二硫苏糖醇的浓度为20mmol/L? 200mmol/L〇 本专利技术的另一个优选实施方案是细菌裂解液中TE(pH7.4)由lOmmol/LTris-HCl、 lmmol/LEDTA组成，pH为 7· 4。 本专利技术提供的细菌快速裂解试剂盒可以提取临床和食品样本中的细菌DNA，其中 临床和食品样本包括菌液、咽拭子、肛拭子、粪便、牛奶、面包，细菌包括革兰氏阳性菌和革 兰氏阴性菌。 本专利技术另一个目的是提供一种细菌快速裂解的检测方法，包括不同样本类型的步 骤如下： 1、菌液样本 (1) 取过夜菌液100μ1离心弃上清收集菌体，或取一个菌落，将菌与50μ1细菌裂 解液混合，用枪头吹吸混匀； (2) 将混合物置于95 °C孵育5min; (3) 将孵育后的混合物在12, 000rpm条件下离心2min，收集上清，即为细菌的核酸提 取物。 2、咽拭子和肛拭子样本： (1) 待检拭子样本直接置于200μ1细菌裂解液中，充分搅拌洗脱拭子上的样本，在管 壁挤压数次后弃拭子； (2) 震荡混匀，95 °C孵育5min; (3) 孵育后的样本12，000rpm离心2min，收集上清，即为拭子样本的细菌核酸提取 物。 3、粪便样本： (1)采集〇. 1-0. 2g粪便样本，采集后立即放入无菌采便管内，加入Iml无菌生理盐水， 震荡混勻，12，000rpm离心2min,弃上清，重复以上步骤再次洗漆沉淀，弃上清后用Iml 无菌生理盐水重悬沉淀，静置5min; (2) 取样本悬液(生理盐水悬液）25μ?，加入25μ?细菌裂解液，震荡混匀，95°C孵育5 min； (3) 孵育后的样本12，OOOrpm离心2min，收集上清，即为粪便样本的细菌核酸提取 物。 4、牛奶样本： (1) 取牛奶〇. 5ml于I. 5ml的无菌离心管中，12，000rpm离心5分钟，去最上层奶 油与中间层上清，沉淀加Iml无菌生理盐水吹打混匀； (2) 取样本悬液(生理盐水悬液）25μ?，加入25μ?细菌裂解液，震荡混匀，95°C孵育5 min； (3) 孵育后的样本12，000rpm离心2min，收集上清，即为牛奶样本中的细菌核酸提 取物。 5、面包样本： (1) 取面包0. 3?0. 5g加入IOml无菌生理盐水中，震荡30s，静置5min; (2) 取样本悬液(生理盐水悬液）25μ?，加入25μ?细菌裂解液，震荡混匀，95°C孵育5 min； (3) 孵育后的样本12，000rpm离心2min，收集上清，即为面包样本中的细菌核酸提 取物。 该核酸提取物可直接用于PCR扩增或荧光PCR检测，也可置于-20 °C长期保存。 本专利技术与现有技术相比，具有如下优点：①组分简单，且无昂贵的试剂，大大节约 成本；②步骤简单，仅需三步；③提取速度快，整个提取过程不超过10分钟；④样本中的 核酸均保留在细菌裂解液中，核酸没有损失，且无需纯化，用于PCR扩增或荧光PCR检测，灵 敏度高于现有技术。⑤无需核酸提取仪本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种细菌快速裂解试剂盒，试剂盒包括：（1）装有细菌裂解液的试剂瓶或管，和（2）分隔并集中包装这些试剂瓶或管的包装盒，其中细菌裂解液由月桂酰基肌氨酸钠、二硫苏糖醇、pH7.4的TE组成。

【技术特征摘要】
1. 一种细菌快速裂解试剂盒，试剂盒包括：（1)装有细菌裂解液的试剂瓶或管，和（2) 分隔并集中包装这些试剂瓶或管的包装盒，其中细菌裂解液由月桂酰基肌氨酸钠、二硫苏 糖醇、PH7.4的TE组成。2. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征还在于细菌裂解液中月桂酰基肌氨酸钠的最 佳浓度为5g/L。3. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征还在于细菌裂解液中二硫苏糖醇的浓度为 20mmol/L ?200mmol/L。4. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征还在于细菌裂解液中pH7. 4的TE由lOmmol/ L Tris、lmmol/L EDTA 组成，pH 为 7. 4。5. 根据权利要求1所述的试剂盒用于提取临床和食品样本中的细菌DNA，其中临床和 食品样本包括菌液、咽拭子、肛拭子、粪便、牛奶、面包，细菌包括革兰氏阳性菌和革兰氏阴 性菌。6. -种细菌快速裂解的检测方法，针对菌液样本包括如下检测步骤： (1) 取过夜菌液100 Pi离心弃上清收集菌体，或取一个菌落，将菌与50 yl细菌裂解 液混合，用枪头吹吸混匀； (2) 将混合物置于95°C孵育5min ; (3) 将孵育后的混合物在12, OOOrpm条件下离心2min，收集上清，即为细菌的核酸提 取物。7. -种细菌快速裂解的检测方法，针对咽拭子和肛拭子样本包括如下检测步骤： (1)待检拭子样本直接置于200 yl细菌裂解液中，充分搅拌洗脱拭子上的样本，在管 壁挤压数次后弃拭子； ⑵震荡混匀，95°C孵育5min; (3)孵育后的样本12...

【专利技术属性】
技术研发人员：金鑫，张钦，张平，周正峰，朱坤，
申请(专利权)人：南京美宁康诚生物科技有限公司，北京美康生物技术研究中心有限责任公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32