本发明专利技术属于基因表达分析技术领域，公开了CmEF1α基因和CmRAN基因在分析甜瓜果实的基因表达时作为内参基因的应用，所述CmEF1α基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述CmRAN基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。本发明专利技术还公开了一种采用实时荧光定量PCR分析甜瓜果实基因表达的方法，它是将CmEF1α基因和CmRAN基因组合的几何平均数作为甜瓜果实基因表达分析中的内参基因。CmEF1α基因和CmRAN基因在不同坐果方式的甜瓜果实的不同发育阶段均能稳定表达，是甜瓜果实发育过程中利用实时荧光定量PCR技术检测基因表达分析的可靠内参基因组合。
【技术实现步骤摘要】
CmEFIα基因和CmRAN基因在甜瓜果实基因表达分析中作 为内参基因的应用
本专利技术属于植物分子生物学
，涉及采用实时荧光定量PCR方法分析甜瓜 果实基因表达过程中所需的内参基因。
技术介绍
甜瓜（CucumismeloL.)是一种世界广泛栽培的葫芦科作物，具有重要的经济价 值。甜瓜果实在大小、颜色、甜度、风味以及质地方面表现出丰富的多样性。此外，基于果实 成熟过程中的呼吸速率和乙烯变化趋势不同，甜瓜又可分为呼吸跃变型和非呼吸跃变型。 因此，在果实发育研究方面，甜瓜被认为是一种理想的模式植物。 分析甜瓜果实发育中基因的表达是研究其果实膨大和成熟机制的重要手段。实时 荧光定量PCR(简称为qRT-PCR)由于灵敏度高、重复性好，已经成为基因表达定量分析的首 选方法。然而该技术由多个步骤构成，从样本收集到数据分析，存在着很多非生物变异，这 些变异会影响结果的准确性。为了克服非生物变异的影响，确保结果的准确性，选择表达稳 定的基因作为内参进行数据的标准化最为关键。 目前，应用qRT-PCR进行甜瓜果实中基因表达定量分析的内参基因有Actin、 Cyclophilin、GAPDH，但这些基因在甜瓜果实中的表达稳定性并没有被系统地评估过。有 研究筛选出了在甜瓜根、茎、叶中表达稳定的内参基因（Kong，Q.Yuan，J.Niu，P.Xie，J. Jiang,ff.Huang,Y.Bie,Z. ,ScreeningSuitableReferenceGenesforNormalizationin ReverseTranscriptionQuantitativeReal-TimePCRAnalysisinMelon.PLoSONE 2014, 9,e87197 ；Sestili,S.Sebastiani,M.Belisario,A.Ficcadenti,N. ,Referencegene selectionforgeneexpressionanalysisinmeloninfectedbyFusariumoxysporum f.sp.melonis.JournalofPlantBiochemistryandBiotechnology2013, 1-11),但不包 括果实。使用表达不稳定的基因作为内参会导致目的基因的表达数据发生很大的偏差，因 此，在甜瓜果实中缺乏系统验证的内参基因的状况将会严重影响甜瓜果实发育过程中进行 基因表达定量分析的准确性。同时，甜瓜基因组序列及大规模转录组序列的公布将加速功 能基因组学的研究，尤其是对甜瓜果实发育和成熟机制的研究。因此，甜瓜果实中稳定表达 内参基因的筛选尤为最要。 授粉和单性结实是甜瓜生产中普遍采用的坐果方式。自然授粉的坐果方式多在在 露天种植中采用，然而，由CPPU(N-(2-chloro_4-pyridyl)-N' -phenylurea)诱导的单性结 实则主要在由温室生产中应用。CPPU是一种人工合成的细胞分裂素，能够在缺乏受精作用 下诱导单性结实。两种不同的坐果方式能够在随后果实发育中引起不同的基因表达和调控 模式，这给甜瓜果实发育中筛选稳定表达内参基因提供了一个很好的机会。 糖的含量及组成成分是评判甜瓜果实质量的主要指标之一。成熟甜瓜果实中的 糖主要是蔗糖。现有研究表明，可溶性酸性转化酶（Al)和蔗糖磷酸合成酶（SPS)是甜瓜 果实中蔗糖的合成代谢中的关键催化酶。在甜瓜基因组上分别鉴别出编码AI的两个基因 (CmAINl和CmAIN2)，和编码SPS的三个基因（CmSPSl,CmSPS2,andCmSPS-LIKEl)。然而通 过深度测序发现与成熟甜瓜果实中蔗糖积累相关的基因只有CmAIN2和CmSPSl(Dai,N.; Cohen,S. ；Portnoy,V. ；Tzuri,G. ；Harel-Beja,R. ；Pompan-Lotan,M. ；Carmi,N.； Zhang,G. ；Diber,A. ；Pollock,S. ；Karchi,H. ；Yeselson,Y. ；Petreikov,M. ；Shen,S.； Sahar,U. ；Hovav,R. ；Lewinsohn,E. ；Tadmor,Y. ；Granot,D. ；0phir,R. ；Sherman,A.； Fei,Z. ；Giovannoni,J. ；Burger,Y. ；Katzir,N. ;Schaffer,A.A. ,Metabolismofsoluble sugarsindevelopingmelonfruit:aglobaltranscriptionalviewofthemetabolic transitiontosucroseaccumulation.PlantMolecularBiology2011, 76, 1-18) 〇 因此， 在甜瓜果实发育中，可通过对CmAIN2和CmSPSl的相对表达定量、Al和SPS酶活性及蔗糖 积累的平行分析，评价内参基因的可靠性。
技术实现思路
为解决在甜瓜果实发育过程中进行基因表达定量分析时缺乏经系统验证的、表达 稳定的内参基因问题，本专利技术提供了专门用于甜瓜果实发育过程中基因表达分析的可靠的 内参基因。 本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案是：选择12个基因作为候选内参基因， 为其中7个候选内参基因设计了跨外显子接头位点的引物，5个候选内参基因设计位于相 邻外显子上的引物；用qRT-PCR分析了这12个候选内参基因在人工授粉和CPPU处理两种 不同坐果方式下22个不同发育时期的甜瓜果实样本中的表达量；用geNorm软件计算候选 内参基因的表达稳定值，确定CmEFlα基因和CmRAN基因为最佳内参组合；用该内参组合 标准化目标基因CmAIN2的表达，并平行分析了其与AI酶活性及蔗糖含量在甜瓜果实成熟 过程中的相关性，验证了CmEFlα和CmRAN组合作为内参基因对甜瓜果实发育过程中基因 表达进行相对定量的可靠性。 本专利技术的特点在于：为候选内参基因设计了跨相邻外显子接头位点或位于相邻外 显子上的特异引物；全面分析了不同坐果方式和不同发育阶段对候选基因表达的影响；筛 选出专门用于甜瓜果实发育过程中基因表达分析的内参组合CmEFlα和CmRAN，并验证了 该组合作为甜瓜果实发育过程中基因表达分析时内参基因的可靠性。 本专利技术的优点是： (1)专门针对于甜瓜果实发育过程中基因表达变化，第一次筛选出了表达稳定的、 适用于做内参的CmEFlα和CmRAN组合。 (2)可靠性。首先，本专利技术考虑到坐果方式和不同发育阶段对候选内参基因表达稳 定的影响，选出了表达最为稳定的内参基因组合；其次，本专利技术通过对CmAIN2和CmSPSl的 表达与甜瓜果实中AI和SPS酶活性变化及蔗糖含量变化的平行分析，证实了CmEFlα和 CmRAN内参基因组合的可靠性。 (3)实用性。本专利技术具有广泛的适用性，可以用于不同坐果方式和不同发育阶段的 甜瓜果实样品中基因表达分析时的内参基因，为甜瓜果实发育中基因表达分析提供了一个 一致的比较标准。 【附图说明】 图I :12个候选内参基因的PCR本文档来自技高网...
【技术保护点】
CmEF1 α基因和CmRAN基因在采用实时荧光定量PCR分析甜瓜果实的基因表达时作为内参基因的应用，所述CmEF1 α基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述CmRAN基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。
【技术特征摘要】
1. CmEFl a基因和CmRAN基因在采用实时荧光定量PCR分析甜瓜果实的基因表达时作 为内参基因的应用，所述CmEFl a基因的核苷酸序列如SEQ ID N0:1所示，所述CmRAN基 因的核苷酸序列如SEQ ID NO :2所示。2. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于：将CmEFl a基因和CmRAN基因组合的几 何平均数作为甜瓜果实基因表达分析中的内参基因。3. -种采用实时荧光定量PCR分析甜瓜果实基因表达的方法，其特征在于：将CmEFl a基因和CmRAN基因组合的几何平均数作为甜瓜果实基因表达分析中的内参基...
【专利技术属性】
技术研发人员：别之龙，孔秋生，高凌云，袁静贤，黄远，程菲，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：湖北;42
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