本发明专利技术公开了一种去除生物制品中细菌内毒素的试剂盒、用该试剂盒去除生物制品中细菌内毒素的方法，以及一种去除内毒素的生物制品的制备方法，本发明专利技术的试剂盒包括阴离子表面活性剂和钾盐；本发明专利技术的方法是用阴离子表面活性剂与生物制品中的内毒素充分结合，形成结合物，再加入钾盐使结合物沉淀，过滤去除沉淀即得到去除内毒素的生物制品溶液，再从该生物制品溶液中分离出生物制品即可。本试剂盒能够简便、高效地去除生物制品中的内毒素、成本低，本发明专利技术的去除内毒素的方法易于操作、不影响生物制品的生物活性且只使用了医药工业准许使用的化合物。用发明专利技术方法制备出的生物制品，其中的内毒素含量符合临床用药标准、活性物质损失少。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物制品的分离纯化领域，特别是涉及一种去除生物制品中细菌内毒素的试剂盒、去除方法及去除内毒素的生物制品的制备方法。
技术介绍
随着现代生物技术的广泛应用，生物制品的安全性受到越来越多的重视，尤其是对生物制品中的热原控制得越来越严格。但是在生物制品的生产过程中，常会因原辅料、生产环境以及个人操作等因素引入热原，在采用发酵工艺的药物生产过程中还会因为在生产过程中不可避免地需要将菌种破壁以释放活性物质而引入大量热原，污染生物制品。因此除了在生产环节中采取有效的工艺控制及严格的预防措施减少热原的来源外，如何去除生物制品中的热原成为本领域的重要研究课题，但是迄今为止没有一个简便、高效的方法。热原(Pyrogen)指能引起恒温动物体温异常升高的致热物质。它包括细菌性热原、内源性高分子热原、内源性低分子热原及化学热原等。通常提到的“热原”，主要是指细菌性热原，是某些细菌的代谢产物、细菌尸体及内毒素。细菌内毒素(Endotoxin)是革兰氏阴性菌细胞壁外膜的主要成分之一，其本质是脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)，在化学结构上主要由多糖(Polysaccharide)和类脂A(Lipid A)组成。它的特殊性在于它不是细菌或细菌的代谢产物，而是细菌死亡或解体后才释放出来的一种具有生物活性的物质，而类脂A正是内毒素多种生物活性或毒性反应的主要基团。虽然不同的革兰氏阴性细菌，其LPS的化学组成有一定的差别，但它们都含有类脂A部分，也就是说这个基团没有种属特异性，因此各属细菌内毒素的毒性反应相似，如发热、血液流动力学改变、弥漫性血管内凝血、休克等。因此，为保证生物制品的使用安全，需要将其中的内毒素含量降低到安全范围内[1][2]。比较公认的注射剂内毒素上限值是5EU/kg体重[3]。内毒素的化学性质非常稳定，100℃煮沸条件下不会被破坏；250℃30分钟以上或者180℃3小时以上才能被破坏；浓度为0.1M以上的强酸或者强碱浸泡才能被破坏[2]。在生理条件下具有疏水性和电负性，通常分子量为十几万至上百万道尔顿。通常采用的去除手段有超滤、各种柱层析(如疏水层析、离子交换)、亲和吸附(多粘菌素B、L-组氨酸、多聚-L-赖氨酸、多聚γ-L-谷氨酸交联介质)和浊点萃取法(Triton X-114)等，这些方法能去除或灭活部分内毒素，但是都存在着一定的缺点。比如超滤法只能应用于小分子药物，如果药物分子(譬如抗体)和内毒素分子大小接近，就无法有效分离；柱层析成本高、效率很低，不适合大规模生产中细菌内毒素的去除；阴离子交换树脂对于同样带负电荷的生物分子就无法分离；浊点萃取法(Triton X-114)[4]也存在很大缺点如在操作过程中需要多次萃取，造成质粒中活性物质的损失；处理时需要转换温度，相变后Triton X-114形成极细小雾滴存在于水相，需要高速离心分离，难于工业化操作和控制等等。综上所述，研发一种既能高效率、低成本去除内毒素，又能最大限度地保持生物制品活性的方法是本领域当前的重要课题。
技术实现思路
本专利技术的主要目的是针对现有技术中存在的技术缺陷，提供一种操作简单、能够有效去除生物制品中细菌内毒素的试剂盒；试剂盒包括钾盐和在足量所述钾盐存在下不能溶于水的阴离子表面活性剂。所述阴离子表面活性剂选自十二烷基硫酸钠、脱氧胆酸钠、十二烷基磺酸钠、仲烷基硫酸钠，脂肪醇聚氧乙烯醚硫酸酯钠、油醇硫酸钠、N—油酰基多缩氨基酸钠，烷基苯磺酸钠、α-烯烃磺酸钠、烷基磺酸钠、α-磺基单羧酸酯、脂肪酸磺烷基酯、琥珀酸酯磺酸盐、烷基萘磺酸盐、石油磺酸钠、木质素磺酸钠、烷基甘油醚磺酸钠。优选十二烷基硫酸钠、脱氧胆酸钠。所述阴离子表面活性剂在内毒素去除过程中使用的终浓度取决于溶液中细菌内毒素的浓度，高于内毒素的浓度即可，当内毒素浓度较高时所述阴离子表面活性剂浓度也应该提高。反之则可以使用较低浓度的所述阴离子表面活性剂。通常为质量浓度不低于1wt％，优选5wt％-10wt％。所述含钾盐选自氯化钾、醋酸钾、硫酸钾、碳酸钾、碳酸氢钾、磷酸钾、磷酸一氢钾、磷酸二氢钾和硝酸钾中的一种或几种的组合，优选醋酸钾、氯化钾。所述钾盐在内毒素去除过程中使用的终浓度为不低于能使所述阴离子表面活性剂充分沉淀的浓度，也就是说，只要能使溶液中所述阴离子表面活性剂沉淀完全即可；一般不低于0.3M，优选0.5M-1M。所述阴离子表面活性剂和钾盐可以为固体，也可以为溶液，分别独立包装。本专利技术的另一目的是提供一种能够有效去除生物制品中细菌内毒素的方法，包括以下步骤：将含有内毒素的生物制品样品与足量所述阴离子表面活性剂混合均匀静置，再加入足量所述钾盐混匀使所述阴离子表面活性剂沉淀完全，静置后离心或者过滤，收集清液得到去除内毒素的生物制品样品溶液。所述阴离子表面活性剂在其与含有内毒素的生物制品混合后的溶液中的浓度取决于溶液中细菌内毒素的浓度，高于内毒素的浓度即可，当内毒素浓度较高时所述阴离子表面活性剂浓度也应该提高。反之则可以使用较低浓度的所述阴离子表面活性剂。通常使用质量百分含量不低于1wt％。所述钾盐加至溶液中的终浓度为不低于能使所述阴离子表面活性剂充分沉淀的浓度，也就是只要能使溶液中所述阴离子表面活性剂沉淀完全即可；一般不低于0.3M，优选0.5M-1M。所述生物制品为蛋白或核酸。本专利技术还有一个目的在于提供一种高效率、低成本去除内毒素的生物制品的制备方法，将含有内毒素的生物制品样品与足量所述阴离子表面活性剂混合均匀至阴离子表面活性剂混合，静置。再加入足量所述钾盐混匀至所述阴离子表面活性剂完全被钾盐沉淀完全，静置后离心或过滤；收集清液即是去除内毒素的生物制品样品溶液。再将所述生物制品样品从去除内毒素的生物制品溶液中分离，即得去除内毒素后的生物制品样品。与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：本试剂盒能够简便快捷地去除生物制品中的内毒素。本专利技术的去除内毒素的方法易于操作、成本低，内毒素去除效果显著优于现有方法。而且不影响生物制品的生物活性，用专利技术方法制备出的生物制品，其中的内毒素含量符合临床用药标准、活性物质损失少。附图说明图1所示为实验例1中内毒素浓度-吸光度标准曲线图。具体实施方式本专利技术提供了一种去除生物制品中内毒素的试剂盒，及利用该试剂盒去除生物制品中内毒素的方法，还有利用这种去除内毒素的方法用来制备无内毒素生物制品的方法。本专利技术的核心原理是阴离子表面活性剂与内毒素能够很好地结合，本文档来自技高网...
【技术保护点】
去除生物制品中细菌内毒素的试剂盒，其特征在于，包括钾盐和在足量所述钾盐存在下不能溶于水的阴离子表面活性剂，所述阴离子表面活性剂优选十二烷基硫酸钠、脱氧胆酸钠、十二烷基磺酸钠、仲烷基硫酸钠，脂肪醇聚氧乙烯醚硫酸酯钠、油醇硫酸钠、N—油酰基多缩氨基酸钠，烷基苯磺酸钠、α‑烯烃磺酸钠、烷基磺酸钠、α‑磺基单羧酸酯、脂肪酸磺烷基酯、琥珀酸酯磺酸盐、烷基萘磺酸盐、石油磺酸钠、木质素磺酸钠、烷基甘油醚磺酸钠，更优选的是十二烷基硫酸钠、脱氧胆酸钠。
【技术特征摘要】
1.去除生物制品中细菌内毒素的试剂盒，其特征在于，包括钾盐和在足量所述钾盐存在下不能溶于水的阴离子表面活性剂，所述阴离子表面活性剂优选十二烷基硫酸钠、脱氧胆酸钠、十二烷基磺酸钠、仲烷基硫酸钠，脂肪醇聚氧乙烯醚硫酸酯钠、油醇硫酸钠、N—油酰基多缩氨基酸钠，烷基苯磺酸钠、α-烯烃磺酸钠、烷基磺酸钠、α-磺基单羧酸酯、脂肪酸磺烷基酯、琥珀酸酯磺酸盐、烷基萘磺酸盐、石油磺酸钠、木质素磺酸钠、烷基甘油醚磺酸钠，更优选的是十二烷基硫酸钠、脱氧胆酸钠。
2.根据权利要求1所述试剂盒，其特征在于，所述阴离子表面活性剂在内毒素去除过程中使用的终浓度高于内毒素的浓度；所述终浓度一般为质量浓度不低于1wt％，优选5wt％-10wt％。
3.根据权利要求1或2所述试剂盒，其特征在于，所述含钾盐选自氯化钾、醋酸钾、硫酸钾、碳酸钾、碳酸氢钾、磷酸钾、磷酸一氢钾、磷酸二氢钾和硝酸钾中的一种或几种的组合，优选醋酸钾、氯化钾。
4.根据权利要求3所述试剂盒，其特征在于，所述钾盐在内毒素去除过程中使用的终浓度为不低于能使所述阴离子表面活性剂充分沉淀的浓度，一般不低于0.3M，优选0.5M-1M。
5.一种去除生物制品中细菌内毒素的方法，其特征在于，...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈辉，
申请(专利权)人：陈辉，
类型：发明
国别省市：浙江;33
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