本发明专利技术公开了一种用于检测艰难梭菌高毒力菌株和/或毒素类型的组合物与试剂盒以及方法。本发明专利技术组合物、试剂盒包含核苷酸序列如SEQ ID NO.1-47所示引物、探针和标准品，使用该组合物或试剂盒通过荧光定量PCR可以检测艰难梭菌高毒力菌株和/或毒素类型。本发明专利技术灵敏度高、特异性强，通过检测tcdC基因突变或缺失并配合艰难梭菌毒力基因检测包括tcdA/B、二元毒力基因cdtA/B能准确判断艰难梭菌的毒素类型和毒力。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于抗生素耐药艰难梭菌基因的快速分子诊断领域，具体涉及用于检测艰 难梭菌高毒力菌株和/或毒素类型的组合物与试剂盒以及方法。
技术介绍
艰难梭菌（Clostridium difficile,⑶）是一种具有芽胞结构的革兰氏阳性严格 厌氧杆菌，是全球范围内公认的医院内感染与抗生素性腹泻最为重要的病原微生物。它能 够引起抗生素相关性腹泻、结肠炎、致死性伪膜性肠炎等。2013年，艰难梭菌被美国国家 卫生部列为抗生素相关耐药菌三大病原菌之首，威胁程度指定为"最紧急"。我国已将艰难 梭菌研宄纳入"十二五"国家传染病重大科技专项，由于培养分离条件严格苛刻，相关研宄 报道仍然较少。2015年2月份发表在《新英格兰医学杂志》的最新文章《美国艰难梭菌感 染的负担》显示，在美国每年感染患者超过50万人，死亡人数超过2. 9万，平均病死率为 5. 5-6. 9%，重症死亡率在60%以上，每年用于治疗的医疗费用在100亿美金以上。在中国， 抗生素滥用和严重，据最新报道艰难梭菌感染占院内腹泻中患者人数25%以上，抗生素相 关腹泻中20-30% ;肿瘤放疗患者中感染患者在30%以上。艰难梭菌感染易出现抗生素耐 药、反复复发、传染性、高致死性；在全球范围内，艰难梭菌早已成为医院感染与抗生素耐药 领域臭名昭著的"超级臭虫"。 长期以来一直认为艰难梭菌是一种不能引起严重感染后果的病原微生物，然而最 近十年艰难梭菌感染流行范围、发生率、致死率、复发性等感染特点发生颠覆性变化。自 2002年以来，加拿大、美国以及欧洲一些国家相继发生100多次出现艰难梭菌爆发流行，流 行期间死亡率迅速上升。研宄表明这主要归因于新的艰难梭菌高毒力菌株的出现。在中国， 因艰难梭菌导致的腹泻从5年前的占院内腹泻的0.05%直线上升到最近的28%，院内获得 性艰难梭菌感染从1. 3/1000上升到11. 6/1000,院感人数上升近十倍。 艰难梭菌高毒菌株tcdC突变如图1所示，包括Λ 117突变、18bp缺失和36bp缺 失或39bp缺失或54bp缺失。BI/NAPI/027菌株为美国、加拿大等国家艰难梭菌流行爆发 的驱动菌株，它拥有以往菌株没有的特点，BI/NAP1/027含有tcdC基因117位点缺失引起 tcdC基因发生移码突变，导致tcdC基因翻译提前终止，产生严重截断的65氨基酸残基；部 分BI/NAP1还含有18bp缺失导致tcdC蛋白截断而无法产生功能。tcdC为艰难梭菌A毒素 (tcdA)与B毒素（tcdB)的抑制基因，tcdC突变体菌株较之传统菌株，导致产生16倍以上 毒素 A和产生23倍以上毒素 B，引起喹诺酮类药物耐药；此外BI/NAPI/027菌株也产生二元 毒素 cdtA或cdtB。艰难梭菌078型与BI/NAP1/027有类似的毒素，tcdC基因含有39bp缺 失，并含有184位点突变，导致终止密码子提前出现。由于人与动物之间艰难梭菌078性基 因序列高度一致，这有利于艰难梭菌078型的传播。此外，其他艰难梭菌高度菌株包含36bp 缺失、54bp缺失等，均导致tcdC蛋白截短而无法产生功能。 因此，通过检测tcdC基因突变或缺失并配合艰难梭菌毒力基因检测包括tcdA/B、 二元毒力基因 cdtA/B，有利于确定高毒艰难梭菌感染并检测毒力基因类型。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种用于检测艰难梭菌高毒 菌株和/或毒力类型的组合物。本专利技术的目的还在于提供基于该组合物的试剂盒及检测方 法。本专利技术的组合物、试剂盒及检测方法能够检测高毒菌株tcdC突变（包括Λ 117突变、 18bp缺失和36bp缺失或39bp缺失或54bp缺失）以及艰难梭菌保守基因 ΤΡΙ、毒力基因 tcdA与tcdB、二元毒力基因 cdtA与cdtB。 本专利技术的目的通过下述技术方案实现： -种用于检测高毒艰难梭菌的组合物，为下述引物对中的至少一对： 引物对1: tcdC Λ 117 上游引物：5' -TTGCTCTACTGGCATTTATTTGG-3'，SEQ ID NO. 1， tcdC Λ117 下游引物：5' -ACCATGGTTCAGCATCAGACAA-3'，SEQ ID NO. 2 ; 引物对2: tcdC 上游引物：5' -AGCAAATTGTCTGATGCTGAACC-3'，SEQ ID NO. 4， tcdC 下游引物：5' -TCAGGTGTTCTAGCTAATTGGTCA-3'，SEQ ID NO. 5。 所述的用于检测高毒艰难梭菌的组合物还包括与引物对匹配的探针，与引物对1 匹配的探针为： tcdC Λ 117 探针：5' -FAM/GAAGCTAAAAAGGCTGAAGAACAA/BHQ1-3'，SEQ ID NO. 3 ; 与引物对2匹配的探针为： tcdC 探针：5' -FAM/AGCTAAAAAAGCTGAAGAAGC/MGBNFQ-3'，SEQ ID NO. 6。 引物对1及其匹配的探针的靶核酸是具有Λ 117 (117位点缺失）单核苷酸独特型 (SNP)的tcdC基因，tcdC基因117位点存在A、T、G与缺失等四种基因型（图2)。使用引物 对1及其匹配的探针能够在不使用别的引物或探针的情况下实现高灵敏度检测艰难梭菌 tcdC基因是否含有117位点缺失。另外，引物对2及其匹配的探针的靶核酸是具有18bp、 36bp、39bp或54bp缺失的tcdC基因（图3)，这些缺失是一种在高毒艰难梭菌菌株中确认 的高毒突变，使用能够特异性识别该重叠区域的引物对2及其匹配的探针能够高灵敏度检 测tcdC基因的缺失情况。序列如SEQ ID NO. 6所示的探针能结合tcdC野生型序列而不 能识别tcdC基因缺失（包括18bp、36bp、39bp、54bp缺失）。为了便于描述，本文使用tcdC 18 Λ表示tcdC 18bp、36bp、39bp、54bp四种缺失中任一类型。 一种用于检测艰难梭菌毒素类型（包括tcdA、tcdB、CdtA和cdtB)的组合物，为下 述引物对中的至少一对： 引物对3: tcdB 上游引物 1 :5' -TGGTGTCATGCAGATTGGAGT-3'，SEQ ID NO. 7， tcdB 下游引物 1 :5' -ACTGAACCAGTTGCTGCAATA-3'，SEQ ID NO. 8 ; 引物对4: tcdB 上游引物 2 :5' -TGGTTCAGGAGGAACTTATGC-3'，SEQ ID NO. 10， tcdB 下游引物 2 :5' -ATTTAATAGAAGGTATTTTATC-3'，SEQ ID NO. 11 ; 引物对5: tcdA 上游引物：5' -CCAACACCTTAACCCAGCCA-3'，SEQ ID NO. 13， tcdA 下游引物：5' -ATTGTGGAGCGAGCTTCTGG-3'，SEQ ID NO. 14 ; 引物对6: cdtA 上游引物：5' -GGGAAGGACAAGCACTGTCTTA-3'，SEQ ID NO. 16， cdtA 下游引物：5' -GATAAGCTCCAGGAGAACCTTT-3'，SEQ ID 本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于检测高毒艰难梭菌的组合物，其特征在于：为下述引物对中的至少一对：引物对1：tcdC△117上游引物：5’‑TTGCTCTACTGGCATTTATTTGG‑3’，tcdC△117下游引物：5’‑ACCATGGTTCAGCATCAGACAA‑3’；引物对2：tcdC上游引物：5’‑AGCAAATTGTCTGATGCTGAACC‑3’，tcdC下游引物：5’‑TCAGGTGTTCTAGCTAATTGGTCA‑3’。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：殷雷，张良禄，曾蕾，郭骁，
申请(专利权)人：武汉大学，
类型：发明
国别省市：湖北;42
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