呕吐毒素的均相免疫检测试剂盒及检测方法技术

本发明专利技术公开了一种呕吐毒素的均相免疫检测试剂盒，其包括：受体微球、供体微球、生物素化呕吐毒素、呕吐毒素标准品；其中，所述受体微球包被有呕吐毒素抗体，所述供体微球包被有链霉亲和素。本发明专利技术还公开了呕吐毒素的均相免疫检测方法。本发明专利技术制备的检测试剂盒中的检测试剂稳定，灵敏、准确，具备适用面广、检测范围宽、灵敏度高、特异性强、检测通量大、线性范围较宽等优点。提供的检测呕吐毒素的方法，一方面，有效降低了非特异性反应的可能性以及背景噪音的影响，显著提高了分析效率和检测灵敏度；另一方面大大缩短检测时间，并可在现场快速检测粮食谷物中的呕吐毒素残留，检测全过程控制在20分钟之内，检测限符合中国及欧盟的限量标准。

【技术实现步骤摘要】
呕吐毒素的均相免疫检测试剂盒及检测方法
本专利技术涉及一种霉菌毒素残留的免疫化学快速检测技术，具体涉及呕吐毒素的均相免疫检测试剂盒及检测方法。
技术介绍
呕吐毒素最早于1970年在日本的一次赤霉病大麦中毒的病毒中发现，可引起动物拒食和呕吐现象。呕吐毒素作为一种常见的真菌毒素，在自然界中广泛存在，主要污染小麦、玉米等粮食作物及其制品。由于呕吐毒素较强的毒性，世界各国都高度重视对其的监控，并制定出严格的限量标准：美国食品药品管理局(FDA)规定在小麦成品中的限量为1000μg/kg，欧盟规定谷粉和玉米粉中限量为750μg/kg，我国在国家标准中规定谷物中呕吐毒素的限量为1000μg/kg。现有的呕吐毒素检测方法主要有理化方法、ELISA方法、胶体金层析法等。这些方法各有优缺点，无法满足现场快速检测的需求。理化方法前处理过程复杂、仪器化程度高、操作繁琐、效率低。ELISA方法经过多次洗脱过程，标记物酶易失活，底物见光易分解，环境干扰因素复杂等缺点，且已不能满足越来越低的限量标准。胶体金层析法可以满足现场快速的要求，但是只能定性检测无法得到定量结果。现有一些呕吐毒素定量检测试剂盒，如已公开专利CN101413954A呕吐毒素的酶联免疫吸附检测专用测试盒的制备方法、CN103823064A一种呕吐毒素定量检测试剂盒及其使用方法，公开的试剂盒均采用是酶联免疫分析方法。酶联免疫分析方法是采用固相吸附分离的方法，需要固相材料吸附捕获抗体-待检抗原-标记抗体，由于标记抗体为过量，所以检测前均需要洗涤去除未参加反应的标记抗体。此时，通过检测与待测抗原结合的标记抗体，才能与待测抗原呈正比例关系。固相吸附分离方法有两个重要环节：包被和洗涤。固相吸附分离方法设计巧妙，操作简单，故应用非常广泛。但是，此种非均相反应模式因包被和洗涤环节的存在，给标记免疫分析造成很大缺陷，主要表现在以下两个方面：1.在包被过程，无论物理吸附还是化学连接，包被于固相材料表面的抗体分子其构象不同于处于液相中的抗体分子，与抗原分子结合能力因空间位阻效应将受到一定限制；无论采用微球还是微孔板作为固相材料，由于包被面积有限，捕获抗体分子不能最大限度满足大量待测抗原的需要，由此将影响检测范围。2.“洗板”或“洗球”是非均相免疫分析中的重要环节且多次出现。洗涤过程增加检测程序的复杂性，增加检测时间并给实现自动化带来障碍。此外，由于洗涤过程特别是酶免疫分析，难于实现标准化，每个测试孔之间洗涤效果不同，在一定程度上影响检测的精密度，出现批间、批内差异。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种呕吐毒素的均相免疫检测试剂盒及检测方法，以解决现有检测盒中试剂种类多，其检测方法操作繁琐，检测灵敏度低的问题。本专利技术的另一个目的是提供一种呕吐毒素的均相免疫检测方法。为实现本专利技术的目的，采用以下技术方案。一种呕吐毒素的均相免疫检测试剂盒，其包括如下试剂：受体微球、供体微球、生物素化呕吐毒素、呕吐毒素标准品；其中，所述受体微球包被有呕吐毒素抗体，所述供体微球包被有链霉亲和素。如上所述的呕吐毒素均相免疫检测试剂盒，优选地，该检测试剂盒还包括样品稀释液，所述样品稀释液为甲醇-PBS溶液。如上所述的呕吐毒素均相免疫检测试剂盒，优选地，所述受体微球的浓度为10μg/mL～30μg/mL，所述供体微球的浓度为10μg/mL～30μg/mL，所述生物素化呕吐毒素浓度为3μg/mL～10μg/mL。如上所述的呕吐毒素均相免疫检测试剂盒，优选地，所述受体微球的缓冲溶液为含有质量百分比为0.2％BSA，体积百分比为0.02％Proclin-300的PBS溶液，所述生物素化呕吐毒素的缓冲液为PBS溶液，所述供体微球的缓冲溶液为终浓度为25mM4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)，100mMNaCl0.05％Proclin-300，pH7.4的溶液。利用如上所述的呕吐毒素均相免疫检测试剂盒检测呕吐毒素的检测方法，包括以下步骤：1)将所述呕吐毒素标准品配置成具有浓度梯度的标准品；2)反应板每孔加入所述受体微球，生物素化呕吐毒素抗原；之后，分别在各孔加入待测样品、步骤1)制备的标准品；3)振荡，室温或37℃避光孵育5min～10min；4)每孔加入所述供体微球，振荡条件下，室温或37℃避光孵育5min～10min；5)结果读取：将反应板置于均相免疫检测仪上读数；6)检测结果分析：根据标准品检测的结果绘制标准曲线，将样品的检测结果对应标准曲线，即可获得检测样品中呕吐毒素的含量。如果待检样品为固体时，要对样品进行前处理，提取上清液进行检测。如上所述的检测方法，优选地，采用80μL反应体系，所述受体微球的加入量为25μL，所述生物素化呕吐毒素的加入量为10μL，所述样品或标准品的加入量为35μL，所述供体微球的加入量为10μL。如上所述的检测方法，优选地，所述步骤(3)中37℃避光孵育的时间为5min，所述步骤(4)中37℃避光孵育的时间为10min。如上所述的检测方法，优选地，所述步骤(6)检测结果分析包括：a.用所获得的每个浓度的标准品溶液的荧光计数值除以呕吐毒素浓度为0的荧光计数值再乘以100％，得到百分荧光计数值；以呕吐毒素标准品浓度的半对数值为X轴，百分荧光计数值为Y轴，绘制标准曲线图；b.按步骤a所述的百分荧光计数值计算方法，计算所述待测样品的百分荧光计数值，相对应该待测样品的百分荧光计数值，则可从标准曲线上读出所述待测样品中呕吐毒素的含量。一种检测呕吐毒素的均相免疫检测方法，包括如下步骤：1)配置具有浓度梯度的呕吐毒素作为标准品；2)反应板每孔加入包被有呕吐毒素抗体的受体微球，生物素化呕吐毒素抗原；之后，分别在各孔加入待测样品、标准品或磷酸盐缓冲液；3)振荡，室温或37℃避光孵育；4)每孔加入包被链霉亲和素的供体微球，振荡条件下室温或37℃避光孵育；5)结果读取：将反应板置于均相免疫检测仪上读数；6)检测结果分析：根据标准品检测的结果绘制标准曲线，将样品的检测结果对应标准曲线，即可获得检测样品中呕吐毒素的含量。本专利技术提供的呕吐毒素的均相免疫检测试剂盒，通过特异性的抗原抗体反应将纳米微珠对极大的拉近，级联化学发光反应将信号放大，有效的提高呕吐毒素检测的精度。该检测试剂盒中的检测试剂稳定，灵敏、准确，具备适用面广、检测范围宽、灵敏度高、特异性强、检测通量大、线性范围较宽等优点。采用本专利技术提供的呕吐毒素均相免疫检测方法，进行呕吐毒素的检测时，操作简单、混合后即可测定，避免了传统免疫分析中洗脱、分离等繁琐过程，一方面，有效降低了非特异性反应的可能性以及背景噪音的影响，显著提高了分析效率和检测灵敏度；另一方面大大缩短检测时间，并可在现场快速检测粮食谷物中的呕吐毒素残留，检测全过程控制在20min之内，检测限符合中国及欧盟的限量标准。利用本专利技术提供的呕吐毒素的均相免疫检测试剂盒，进行呕吐毒素检测的灵敏度为0.006μg/L，检测范围为0.006-1000μg/L，大大高出现有技术ELISA的检测灵敏度。附图说明图1是本专利技术一优选实施例检测呕吐毒素的标准曲线。具体实施方式本专利技术的呕吐毒素免疫均相检测的原理，采用抑制法检测待测样品中的呕吐毒素。当样品中没有呕吐毒素时，反应液中的生物素化呕吐毒素抗原，与偶联有呕吐本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种呕吐毒素的均相免疫检测试剂盒，其特征在于，其包括：受体微球、供体微球、生物素化呕吐毒素和呕吐毒素标准品；其中，所述受体微球包被有呕吐毒素抗体，所述供体微球包被有链霉亲和素。

【技术特征摘要】
1.一种呕吐毒素的均相免疫检测试剂盒，其特征在于，其包括：受体微球、供体微球、生物素化呕吐毒素和呕吐毒素标准品；其中，所述受体微球包被有呕吐毒素抗体，所述供体微球包被有链霉亲和素；该检测试剂盒还包括样品稀释液，所述样品稀释液为甲醇-PBS溶液；所述受体微球包被有呕吐毒素抗体的具体步骤如下:(1)抗体的预处理将一定量呕吐毒素抗体加入美国Millipore公司的带有滤膜的离心管中，9000rpm离心8min；将浓缩后的抗体加入0.2mL缓冲液(1)，9000rpm离心8min后弃掉滤液，此步骤重复5-6次；将几次离心后的离心管取出，弃掉滤液，把离心管的滤膜反转，8000rpm离心6min，收集所得滤液，即所需要的抗体；完成后再次将滤膜反转，加入50μL缓冲液(1)，静置片刻，使滤膜将待连接抗体的缓冲液(1)吸收，留在滤膜上的残余抗体溶解下来，将滤膜重新反转过来，8000rpm离心6min，收集滤膜上的液体，以上步骤重复1-3次，以使滤膜上的抗体尽可能多的被回收；(2)抗体浓度的检测采用BCA蛋白定量分析试剂确定步骤(1)中抗体的浓度，按照BCA蛋白定量分析试剂的说明书进行操作，具体步骤如下：1)配置标准品系列浓度：用去离子水将BCA标准品稀释成以下系列浓度:2mg/mL、1.5mg/mL、1mg/mL、0.75mg/mL、0.5mg/mL、0.25mg/mL、0.125mg/mL、0.025mg/mL、0mg/mL；2)配置BCA工作液：根据标准品和样品数量配置BCA工作液，将A液、B液按体积比为50:1的比例进行配置，充分混匀；3)待检测样品用去离子水作适当稀释，将25μL上述标准品及样品分别加入到96孔透明板的样品孔中；各孔加入200μLBCA工作液，37℃孵育30min；4)将板条放置室温数分钟，将其冷却至室温，用酶标仪570nm波长测定，根据标准曲线计算抗体浓度，并将抗体浓度调整成2mg/mL；(3)抗体和微球的偶联将呕吐毒素抗体和偶联有二抗的受体微球按照1:10的浓度比进行混匀，用缓冲液(1)将体积补充到200μL，室温下振荡1小时；(4)纯化16000rpm离心15min后去上清，再加入一定量的保存缓冲液将受体微球重悬，再次16000rpm离心15min后去上清，重复此步骤二次，最后用保存缓冲液将其沉淀超声重悬，得到已连接抗体的受体微球，调整受体微球浓度为10μg/mL～30μg/mL待用；(5)保存分装为50μL的小管，4℃保存；所述缓冲液(1)：用0.13mol/L，pH8.0的PBS配制25mg/mL氰基硼氧化钠，现配现用，所述保存缓冲液：为含有质量百分比为0.2％BSA，体积百分比为0.02％Proclin-300的PBS溶液，具体配置如下：1L的双蒸水加入KCl0.2g，KH2PO40.2g，NaCl8g,Na2HPO4·12H2O3.4g，2gBSA，0.2mLProclin-300，混匀，室温保存；其中，上述步骤(3)中抗体和微球的偶联采用水溶性碳二亚胺法，将表面修饰有活性羧基的受体微球与呕吐毒素抗体共价偶联；所述生物素化呕吐...

【专利技术属性】
技术研发人员：张峰，凌云，雍炜，邢仕歌，陈达，金涌，
申请(专利权)人：中国检验检疫科学研究院，
类型：发明
国别省市：北京;11