一种检测人超敏C反应蛋白用微流控纸芯片及其制备方法和试剂盒技术

本发明专利技术提供了一种检测人超敏C反应蛋白用微流控纸芯片的制备方法，1)在电脑上设计纸芯片的图案；2)用喷蜡打印机将图案打印到空白的纸芯片上，圆形图案区域为检测区；3)将所述步骤2)得到的纸芯片进行烘烤后冷却，得到预处理纸芯片；4)在所述步骤3)得到的预处理纸芯片的检测区包被超敏C反应蛋白一抗溶液后依次干燥、洗涤，得到包被纸芯片；所述超敏C反应蛋白一抗溶液的包被浓度为10～100μg/ml；5)用封闭液封闭所述步骤4)中得到的包被纸芯片的检测区，封闭后的纸芯片经孵育，洗涤和干燥，得到检测人超敏C反应蛋白用微流控纸芯片。本发明专利技术提供的所述方法操作简单、重复性好，适合工业批量生产。

Micro fluidic chip for detecting human hypersensitivity C reaction protein, preparation method and kit thereof

The present invention provides a method for preparing microfluidic chip with a paper detection of high sensitivity C reactive protein, 1) paper on the computer chip design pattern; 2) using the spray wax printer will print paper pattern to chip blank on the circular pattern area for the detection area; 3) the 2 steps the baking paper) chip cooling, preprocessing of paper; 4) in the step 3) the paper pretreatment chip detection zone is coated with an anti hypersensitive C reactive protein solution followed by drying, washing, get coated paper chips; the anti hypersensitive C reaction protein solution concentration for coating was 10 ~ 100 g/ml; 5) with closed liquid closed the step 4) in the envelope detection zone paper chip, chip paper after sealing after incubation, washing and drying, the paper obtained the microfluidic chip for detection of human high sensitivity C reactive protein. The method provided by the invention has the advantages of simple operation and good repeatability, and is suitable for industrial batch production.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于免疫检验
，具体涉及一种检测人超敏C反应蛋白用微流控纸芯片及其制备方法和试剂盒。
技术介绍
C反应蛋白(C-reactiveprotein，CRP)，是Tillet和Francis于1930年在急性大叶性肺炎患者血清中发现的，因其在钙离子存在时能和肺炎双球菌细胞壁的C多糖起沉淀反应而得名，是相对分子质量为115-140KD的血清β球蛋白。关于CRP的研究已经有70多年的历史，传统观点认为CRP是一种非特异的炎症标志物。CRP在临床上主要用于评价感染、组织损伤和炎症性疾病，同时为炎症性疾病的诊断提供数据支持，也可为疾病的治疗和监控提供诊疗信息。随着检测技术的进步，采用超敏感方法检测到的CRP被称为超敏CRP(HS-CRP)。近年来，大量的文章研究显示，HS-CRP在冠心病、中风、心肌梗死、周围血管栓塞等疾病诊断和预测中发挥越来越重要的作用。在由慢性炎症引发心血管疾病的独立危险因素中CRP的作用已被证实，及时监测CRP的水平变化对心血管疾病的干预及预后起重要作用，且CRP水平越高，发生心脑血管的危险性就越大。因此欧美等发达国家已将HS-CRP作为预防心血管疾病的相对独立的一个新的筛查指标。有学者认为CRP是心血管疾病危险评估的“金标准”，是心血管疾病强有力的预示因子与危险因子。目前在临床上常规测定CRP的主要方法有放射免疫法、免疫比浊法、胶体金免疫层析法以及ELISA法等。放射免疫法结果较准确，线性范围较宽，灵敏度可达3ng/mL，但是操作繁琐且存在同位素污染问题，已逐渐被其它方法所代替。免疫比浊法目前应用广泛，但其检测灵敏度较低约为5μg/mL，且通常需要自动生化分析仪和自动化免疫测定仪等大型仪器，操作复杂耗时长，所需样本量大。胶体金免疫层析法具有快速、便捷、价廉及适合单人份操作等优点，但是只能定性或半定量检测，易出现误判，灵敏度低。而ELISA法检测CRP的检测灵敏度达到10～39ng/ml(专利号为CN201110257767.9，CN201510673472.8和CN201510673472.8)。目前还没有针对CRP的高灵敏度快速检测的试纸装置。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种检测人超敏C反应蛋白用微流控纸芯片及其制备方法和试剂盒，使所述微流控纸芯片具有较高的检测灵敏度。为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：本专利技术提供了一种检测人超敏C反应蛋白用微流控纸芯片的制备方法，包括以下步骤：1)在电脑上设计纸芯片的图案；2)用喷蜡打印机将图案打印到空白的纸芯片上，圆形图案区域为检测区；3)将所述步骤2)得到的纸芯片进行烘烤后冷却，得到预处理纸芯片；4)在所述步骤3)得到的预处理纸芯片的检测区包被超敏C反应蛋白一抗溶液后依次干燥、洗涤，得到包被纸芯片；所述超敏C反应蛋白一抗溶液的包被浓度为10～100μg/ml；5)用封闭液封闭所述步骤4)中得到的包被纸芯片的检测区，封闭后的纸芯片经孵育，洗涤和干燥，得到检测人超敏C反应蛋白用微流控纸芯片。优选的，所述步骤1)中图案的形状包括圆形或矩形；所述图案按照矩阵排列；所述纸芯片上图案的个数包括24、48或96个；相邻图案的中心之间的距离为15～20mm；每个图案的面积为70～90mm2。优选的，所述步骤3)中烘烤温度为100～120℃；烘烤的时间优选为10～40s。优选的，所述步骤4)中超敏C反应蛋白一抗溶液的包被浓度为20～80ug/ml。优选的，所述步骤4)和步骤5)中干燥的温度独立为20～30℃；干燥的时间为5～20min。优选的，所述步骤4)和5)中洗涤用洗涤液为PBST缓冲液；所述PBST缓冲液为含有体积浓度0.05％Tween-20的PBS缓冲液；PBS缓冲液的pH值为7.2～7.4。优选的，所述步骤5)中封闭液为含有质量浓度5％BSA的PBST缓冲液；PBST缓冲液的pH值为7.2～7.4。优选的，所述步骤5)中孵育的时间为5～20min；孵育的温度为20～30℃。本专利技术提供了所述的方法制备的检测人超敏C反应蛋白的微流控纸芯片，由纸芯片、附着在纸芯片疏水区域上的蜡和附着在纸芯片亲水区域的人超敏C反应蛋白抗体组成；所述疏水区域将亲水区域包围。本专利技术还提供了一种检测人超敏C反应蛋白用试剂盒，包括权利要求1～8任意一项所述的方法制备的微流控纸芯片或权利要求9所述的微流控纸芯片，0.5～5μg/ml生物素标记的人超敏C反应蛋白二抗、0.5～2μg/mlHRP-链霉亲和素、化学发光底物液、人超敏C反应蛋白标准品。本专利技术提供了一种检测人超敏C反应蛋白用微流控纸芯片的制备方法，1)在电脑上设计纸芯片的图案；2)用喷蜡打印机将图案打印到空白的纸芯片上，圆形图案区域为检测区；3)将所述步骤2)得到的纸芯片进行烘烤后冷却，得到预处理纸芯片；4)在所述步骤3)得到的预处理纸芯片的检测区包被超敏C反应蛋白一抗溶液后依次干燥、洗涤，得到包被纸芯片；所述超敏C反应蛋白一抗溶液的包被浓度为10～100μg/ml；5)用封闭液封闭所述步骤4)中得到的包被纸芯片的检测区，封闭后的纸芯片经孵育，洗涤和干燥，得到检测人超敏C反应蛋白用微流控纸芯片。本专利技术提供的所述方法操作简单、重复性好，适合工业批量生产。本专利技术提供的方法制备的纸芯片作为一种新型的检测技术具有价格低廉、可便携式、生物相容性好、简单快速、试剂消耗量小和设计灵活等特点，已显示出其在POCT诊断平台的强大生命力；同时所述纸芯片保存时间长，在4℃至少可以保存6周。本专利技术提供的试剂盒是在纸芯片的化学发光免疫分析(CLIA)法中，引入了生物素-亲和素系统来放大信号，提高了纸芯片的检测信噪比，从而提高检测灵敏度。检测的灵敏度可达0.5ng/mL，远远超过用于快速检测的免疫层析试纸的灵敏度至少一个数量级以上；接近部分HS-CRPELISA试剂盒的检测性能。该灵敏度可以满足对于预防心血管疾病的POCT快速检测的需要。进一步的，本专利技术提供的试剂盒，通过进一步限定两种抗体的浓度和种类，实现了纸芯片在生物大分子的应用。本专利技术首次将微流控纸芯片用于检测CRP。附图说明图1为微流控纸芯片的示意图；图2为测量灵敏度的标准曲线；图3为纸芯片与ELISA试剂盒CRP检测结果的相关性。具体实施方式本专利技术提供了一种检测人超敏C反应蛋白用微流控纸芯片的制备方法，包括以下步骤：1)在电脑上设计纸芯片的图案；2)用喷蜡打印机将图案打印到空白的纸芯片上，圆形图案区域为检测区；3)将所述步骤2)得到的纸芯片进行烘烤后冷却，得到预处理纸芯片；4)在所述步骤3)得到的预处理纸芯片的检测区包被超敏C反应蛋白一抗溶液后依次干燥、洗涤，得到包被纸芯片；所述超敏C反应蛋白一抗溶液的包被浓度为10～100μg/ml5)用封闭液封闭所述步骤4)中得到的包被纸芯片的检测区，封闭后的纸芯片经孵育，洗涤和干燥，得到检测人超敏C反应蛋白用微流控纸芯片。本专利技术首先在在电脑上设计纸芯片图案。本专利技术中，所述纸芯片优选WhatmanTM1号层析纸。本专利技术中，所述设计的方法优选采用Adobeillustrator绘图软件进行设计。本专利技术中，所述图案的形状优选包括圆形或矩形。所述图案优选按照矩阵排列。所述纸芯片上图案的个数没有特殊限本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测人超敏C反应蛋白用微流控纸芯片的制备方法，包括以下步骤：1)在电脑上设计纸芯片的图案；2)用喷蜡打印机将图案打印到空白的纸芯片上，圆形图案区域为检测区；3)将所述步骤2)得到的纸芯片进行烘烤后冷却，得到预处理纸芯片；4)在所述步骤3)得到的预处理纸芯片的检测区包被超敏C反应蛋白一抗溶液后依次干燥、洗涤，得到包被纸芯片；所述超敏C反应蛋白一抗溶液的包被浓度为10～100μg/ml；5)用封闭液封闭所述步骤4)中得到的包被纸芯片的检测区，封闭后的纸芯片经孵育，洗涤和干燥，得到检测人超敏C反应蛋白用微流控纸芯片。

【技术特征摘要】
1.一种检测人超敏C反应蛋白用微流控纸芯片的制备方法，包括以下步骤：1)在电脑上设计纸芯片的图案；2)用喷蜡打印机将图案打印到空白的纸芯片上，圆形图案区域为检测区；3)将所述步骤2)得到的纸芯片进行烘烤后冷却，得到预处理纸芯片；4)在所述步骤3)得到的预处理纸芯片的检测区包被超敏C反应蛋白一抗溶液后依次干燥、洗涤，得到包被纸芯片；所述超敏C反应蛋白一抗溶液的包被浓度为10～100μg/ml；5)用封闭液封闭所述步骤4)中得到的包被纸芯片的检测区，封闭后的纸芯片经孵育，洗涤和干燥，得到检测人超敏C反应蛋白用微流控纸芯片。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤1)中图案的形状包括圆形或矩形；所述图案按照矩阵排列；所述纸芯片上图案的个数包括24、48或96个；相邻图案的中心之间的距离为15～20mm；每个图案的面积为70～90mm2。3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤3)中烘烤温度为100～120℃；烘烤的时间优选为10～40s。4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤4)中超敏C反应蛋白一抗溶液的包被浓度为20～80μg/ml。5...

【专利技术属性】
技术研发人员：李峥，张美姿，李明，史旺林，胡肖传，李鑫杰，
申请(专利权)人：航天神舟生物科技集团有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11