用于线粒体全基因组检测的引物组合及试剂盒制造技术

本发明专利技术涉及线粒体全基因组检测的引物组合及试剂盒，本发明专利技术利用PCR和Sanger测序技术检测线粒体全基因组以辅助诊断由于mtDNA突变导致的线粒体病。本发明专利技术先利用6对特异性引物来扩增整个线粒体基因组，每个扩增产物大小在2700‑3500bp之间，且相邻的扩增片段具有200bp以上的重叠，然后利用21个测序引物对扩增产物直接测序，测序范围覆盖整个线粒体基因组。利用本发明专利技术的引物组合，只需6个扩增反应和21个测序反应就能检测整个线粒体基因组，大大减少了检测工作量，同时检测成本也大幅减少。

【技术实现步骤摘要】
用于线粒体全基因组检测的引物组合及试剂盒
本专利技术涉及生物技术检测领域，具体涉及线粒体全基因组检测的引物及试剂盒。
技术介绍
线粒体病(mitochondriopathy)是由遗传缺损引起线粒体代谢酶缺陷，导致ATP合成障碍，能量来源不足而出现的一组多系统疾病或组织特异性疾病。线粒体是细胞内产生能量的细胞器。除了红血细胞外，它存在于人体内的每一个细胞中。线粒体的主要功能是提供细胞所需要的能量-三磷酸腺苷(ATP)。线粒体有自己的一套遗传控制系统，同时也受到核DNA的控制。线粒体DNA(mtDNA)一旦发生突变，将会导致编码线粒体氧化代谢过程必需的酶或载体发生障碍，糖原和脂肪酸等不能进入线粒体使得ATP合成受阻，导致能量代谢障碍和产生复杂的临床症状。据文献报道，线粒体病发病率大约为1/5000，线粒体病可由核基因组DNA突变或mtDNA突变导致，而由mtDNA突变导致的线粒体病大约占15％。常见的线粒体病主要有线粒体病伴高乳酸血症和卒中样发作综合征(MELAS)、肌阵挛性癫痫伴肌肉蓬毛样红纤维综合征(MERRF)、慢性进行性眼外肌麻痹综合征(KSS)、原发性线粒体脑病Leigh综合征、Leber遗传性视神经病(LHON)、Pearson综合征等。人类线粒体基因组全长16569bp，总共包含37个基因，其中13个编码功能蛋白(呼吸链复合物)，2个编码rRNA(16S和12S)，2个编码tRNA。mtDNA突变在人群中非常普遍，据文献报道，200个初生儿中就有一个携带有10个常见mtDNA致病性突变的其中一个突变。mtDNA突变遍布整个线粒体基因组，已发现的点突变种类就多达500多种，常见的点突变位点有m.3243A>G、m.3460G>A、m.1555A>G、m.8344A>G等。线粒体基因组结构和常见突变位点的分布情况如图1所示。对mtDNA进行检测，常用的也是最简单的方法就是设计特异性引物对线粒体基因组进行扩增，然后对扩增产物进行测序。目前用于mtDNA检测的方法主要分为2大类：1.Sanger测序。该方法相对简单，为目前主流的检测方法。目前此方法存在的主要问题是扩增反应和测序反应数均较多，文献报道的扩增反应数大多在10个以上(最少9个)，测序反应数最多达到66个。2.高通量测序(NGS)。检测流程为先利用长片段PCR扩增出整个线粒体全基因组，之后将扩增产物片段化并进行文库制备，然后将文库上机测序，最后对测序数据进行分析和解读。虽然该方法通量很高，但流程复杂，成本也较高。Sanger测序技术自从上世纪70年代诞生以来，目前已在临床检测领域广泛应用，并成为基因检测的金标准。Sanger测序读长最大能达到1000bp。由于线粒体基因组全长16kb，要想通过Sanger测序技术获得线粒体基因组全长必须设计多个引物分段扩增，测序后再进行拼接，虽然较小的扩增片段(500-1000bp)的最适合后续的Sanger测序，但需要做30-40个扩增反应以及40个以上的测序反应，不仅工作量大，检测成本也较高。另外，虽然可以通过1-4个长片段PCR(Long-rangePCR)就能扩增出线粒体基因组全长，然而长片段的产物不适合进行后续的Sanger测序。综合来看，用Sanger测序技术来检测线粒体基因组其扩增产物大小在3000-4000bp最适宜。利用Sanger测序来检测mtDNA最大的难点在于引物设计，主要原因是：1.线粒体基因组序列与核基因组序列具有高度同源性(核基因组中存在大量的NUMTs)，引物设计不当将会对核基因组DNA进行非特异性扩增。2.线粒体基因组序列具有高度的多态性，如果引物设计在具有多态性的位置，那么会由于引物与模板序列错配而导致扩增失败。我们经过大量的工作和尝试，在引物上精心设计，在扩增体系和条件上不断优化，最终开发出一个操作简便、时间短、成本低的用于线粒体全基因组检测的体系。
技术实现思路
本专利技术提供了线粒体全基因组的检测引物、检测体系和试剂盒。本专利技术利用特异性扩增线粒体基因组的引物和对扩增产物进行测序的引物，通过PCR和Sanger测序技术，检测线粒体基因组的微小变异，从而辅助诊断因mtDNA突变导致的线粒体病。利用本专利技术的引物和检测体系，只需6个扩增反应和21个测序反应就可以对线粒体全基因组进行检测。根据本专利技术的一个方面，提供线粒体全基因组检测的引物组合，包括6组扩增引物对，分别是：用于扩增m.14835-m.1691区域MC1的引物对，其碱基序列为：MC1-F：GATGAAACTTYGGCTCACTCCTMC1-R：GGGTTTGGGGCTAGGTTTAGC；用于扩增m.1216-m.3959区域MC2的引物对，其碱基序列为：MC2-F：CGATAAACCCCGATCAACCTCAMC2-R：CCTGCGGCGTATTCGATGTT；用于扩增m.3706-m.6808区域MC3的引物对，其碱基序列为：MC3-F：CGAGCAGTRGCCCARACAATCMC3-R：GYGTGTCTACGTCTATTCCTACTG；用于扩增m.6418-m.9776区域MC4的引物对，其碱基序列为：MC4-F：AACCCCCTGCCATAACCCAMC4-R：TCGGAAATRGTGAAGGGRGA；用于扩增的m.8963-m.12214区域MC5的引物对，其碱基序列为：MC5-F：ATCAGCCTRYTCATTCAACCAAMC5-R：GCTTYCTCGGTAAAYAAGGGGT；用于扩增m.11965-m.15364区域MC6的引物对，其碱基序列为：MC6-F：CACAGCCCTATACTCCCTCTACATMC6-R：GTTTGATCCYGTTTCGTGYAA；其中上述扩增引物中的简并碱基Y是C和/或T，并且简并碱基R是A和/或G。以上扩增引物在线粒体基因组上的分布如图2所示。MC1-MC6的扩增引物对的产物大小在2700-3500bp之间，并且相邻的扩增产物具有重叠区间，重叠区间大于200bp。本专利技术的引物组合中的各对扩增引物的Tm值都在(60±3)℃的范围内，确保用于扩增的引物在相同体系及扩增条件下，所有的引物对均能出现明亮且较单一的目的条带，确保用于测序的引物在相同体系和条件下均能对目标产物成功测序。根据本专利技术的另一个方面，提供线粒体全基因组检测的扩增反应体系，所述扩增反应体系包括6个单独的扩增反应体系，每个单独的扩增反应体系分别包含MC1-MC6扩增引物对中的一对、聚合酶、PCR反应缓冲液、dNTP和模板DNA。在优选的实施方案中，所述聚合酶是Taq酶。更优选地，所述聚合酶是热启动Taq酶。在优选的实施方案中，所述反应体系的体积为25μl或50μl。根据本专利技术的另一个方面，提供线粒体全基因组检测试剂盒，所述试剂盒包含上述任一种引物组合。在优选的实施方案中，所述试剂盒中还进一步包含聚合酶、PCR反应缓冲液、dNTP。在优选的实施方案中，所述聚合酶是Taq酶。更优选地，所述聚合酶是热启动Taq酶。根据本专利技术的另一个方面，提供线粒体全基因组检测方法，包括以下步骤：(1)制备上述扩增反应体系；(2)进行PCR扩增，扩增程序是：在95℃变性5-15分钟；然后进行30-35个本文档来自技高网...

【技术保护点】
线粒体全基因组检测的引物组合，包括6组扩增引物对，分别是：用于扩增m.14835‑m.1691区域MC1的引物对，其碱基序列为：MC1‑F：GATGAAACTTYGGCTCACTCCTMC1‑R：GGGTTTGGGGCTAGGTTTAGC；用于扩增m.1216‑m.3959区域MC2的引物对，其碱基序列为：MC2‑F：CGATAAACCCCGATCAACCTCAMC2‑R：CCTGCGGCGTATTCGATGTT；用于扩增m.3706‑m.6808区域MC3的引物对，其碱基序列为：MC3‑F：CGAGCAGTRGCCCARACAATCMC3‑R：GYGTGTCTACGTCTATTCCTACTG；用于扩增m.6418‑m.9776区域MC4的引物对，其碱基序列为：MC4‑F：AACCCCCTGCCATAACCCAMC4‑R：TCGGAAATRGTGAAGGGRGA；用于扩增的m.8963‑m.12214区域MC5的引物对，其碱基序列为：MC5‑F：ATCAGCCTRYTCATTCAACCAAMC5‑R：GCTTYCTCGGTAAAYAAGGGGT；用于扩增m.11965‑m.15364区域MC6的引物对，其碱基序列为：MC6‑F：CACAGCCCTATACTCCCTCTACATMC6‑R：GTTTGATCCYGTTTCGTGYAA；其中上述扩增引物中的简并碱基Y是C和/或T，并且简并碱基R是A和/或G。...

【技术特征摘要】
1.线粒体全基因组检测的引物组合，包括6组扩增引物对，分别是：用于扩增m.14835-m.1691区域MC1的引物对，其碱基序列为：MC1-F：GATGAAACTTYGGCTCACTCCTMC1-R：GGGTTTGGGGCTAGGTTTAGC；用于扩增m.1216-m.3959区域MC2的引物对，其碱基序列为：MC2-F：CGATAAACCCCGATCAACCTCAMC2-R：CCTGCGGCGTATTCGATGTT；用于扩增m.3706-m.6808区域MC3的引物对，其碱基序列为：MC3-F：CGAGCAGTRGCCCARACAATCMC3-R：GYGTGTCTACGTCTATTCCTACTG；用于扩增m.6418-m.9776区域MC4的引物对，其碱基序列为：MC4-F：AACCCCCTGCCATAACCCAMC4-R：TCGGAAATRGTGAAGGGRGA；用于扩增的m.8963-m.12214区域MC5的引物对，其碱基序列为：MC5-F：ATCAGCCTRYTCATTCAACCAAMC5-R：GCTTYCTCGGTAAAYAAGGGGT；用于扩增m.11965-m.15364区域MC6的引物对，其碱基序列为：MC6-F：CACAGCCCTATACTCCCTCTACATMC6-...

【专利技术属性】
技术研发人员：周仲春，叶建伟，张捷，崔丹，刘棒，余应襄，
申请(专利权)人：北京圣谷智汇医学检验所有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11