本发明专利技术提供检测高血压相关的线粒体DNA?A4263G突变的试剂盒，由引物序列、提取样本基因组DNA的试剂、PCR扩增反应试剂、阳性标本对照、阴性标本对照以及使用说明书构成。本发明专利技术试剂盒以少量的样本（如一滴毛细血管静脉血、带毛囊的毛发、口腔粘膜刮片或唾液），通过蛋白酶K消化裂解法提取基因组DNA，通过设计引物进行分段巢式PCR扩增，然后通过特异性的限制性内切酶StyⅠ酶切鉴定的方法检出高血压相关的线粒体突变位点。本发明专利技术实现了无创伤检测，较单独进行线粒体DNA?A4263G突变的检测更快速、经济、简便，且对设备及环境要求低，利于推广和应用，适用于高血压相关人群的大规模筛查和预防性检查。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属生物
，涉及用于检测与原发性高血压相关的线粒体DNA A4263G突变的试剂盒，还涉及一种与原发性高血压相关的线粒体基因突变的检测方法，特别涉及检测线粒体tRNAIle A4263G突变的方法，以及上述方法或上述的试剂盒在检测与原发性高血压相关的线粒体DNA A4263G突变中的应用。
技术介绍
心血管疾病是全球范围造成死亡的最主要原因，包括冠心病、高血压、心脏病、中风、心肌病和心力衰竭等一系列涉及循环系统(主要是心脏和血管)的疾病。世界卫生组织(WHO)统计，2008年约有1730万人死于心血管病，占全球死亡人口的30%。《中国心血管病报告2011》显示，目前我国心血管病患者高达2. 3亿，其中高血压患者1. 6亿。每年约300万人死于心血管疾病，其中冠心病死亡人数约100万。心血管疾病已成为我国严重的健康安全问题，给国家和社会带来巨大负担。心血管疾病是一类复杂性疾病，由遗传因素、环境因素或两者相互作用所致。部分高血压疾病呈母系遗传特征，提示mtDNA异常可能是这些高血压疾病发病的分子基础之一。近两年来，我们课题研究组发现原发性高血压与线粒体DNA (Mitochondria DNA, mtDNA)突变存在相关性。在世界上首次发现了由母系遗传的线粒体基因功能缺陷造成原发性高血压的致病机理。这些基因缺陷包括tRNAIle A4263G、tRNAGln/tRNAMet A4401G、tRNAMet A4435G等突变，诠释了母系遗传性高血压的发病机制，为高血压的早期诊断、干预和防治提供了新的理论依据。与线粒 体相关的原发性高血压在早期临床症状不明显，早期的检查常常会因此被耽误，尤其在我国偏远农村地区，这种情况普遍存在。因此，在高危人群和易感人群中开展mtDNA突变筛查，对于预防和控制与线粒体相关的原发性高血压的发生有着极其重要的作用。自发现与mtDNA突变相关的疾病以来，检测线粒体突变位点的检测方法主要还是序列测定。直接测序法是鉴定突变的黄金标准，但该操作繁琐，费用昂贵限制了它的广泛应用。近年来，国内相继报道了检测线粒体突变相关的技术，以满足对线粒体突变进行广泛筛查的需要，如戴朴等人研发的《母系遗传耳聋线粒体基因1555位A — G突变的检测方法及其试剂盒》(公开号CN1490415)，《用于检测母系遗传线粒体耳聋基因A1555G突变的探针及其用途》(公开号CN1987462)，《用于检测母系遗传线粒体耳聋基因C1494T突变的Taqman MGB探针及其用途》(公开号CN1987463)。这些检测方法虽然在一定程度上降低了成本，但操作步骤还不够简便，不能同时检测出mtDNA A1555G和C1494T突变；从某种程度上来说，检测费用还是偏高，这对许多家庭济困难的人来说仍是一笔不小的开支。2006年杭州优思达生物科技有限公司建立一种以单核苷酸多态性核酸试纸快速检测LHON线粒体DNA中G11778A位点突变的方法(专利号200610003429.1)。在应用单核苷酸多态性(SNP)核酸检测试纸条进行多态位点或突变位点的检测时，需设计一特异性要求比较高的延伸引物，这条引物的3’端碱基紧临多态性碱基或突变碱基，其在DNA聚合酶的作用下开始延伸，此时利用带有抗原标记与模板对应的双脱氧单核苷酸(ddNTP)被连接到延伸引物上。虽然该方法能够实现短时间内的检测阳性位点，但PCR扩增条件严格，存在假阴性的几率大大增加。传统上，获得原发性高血压患者基因组DNA的方法是从血液中提取，每人大约需要3 5ml。这种采血方法给很多被检者尤其是婴幼儿带来了一些痛苦和伤害，而且在跨地区传递样本时存在一定的风险和麻烦。因此，迫切需要一种对人体无伤害、无痛苦的获取原发性高血压患者基因组DNA的方法以及一种快速、简便、准确、经济的线粒体相关基因突变检测方法，以满足对线粒体基因突变进行广泛筛查的需要。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对目前检测tRNAIle A4263G突变的方法所存在的缺点，提供一种快速、简便、准确、经济的检测原发性高血压相关的线粒体DNA突变的试剂盒。本专利技术提供的试剂盒，由盒体、引物序列、提取样本基因组DNA的试剂、PCR扩增反应试剂、阳性标本对照、阴性标本对照构成，其中，提取样本基因组DNA的试剂主要由细胞裂解液和溶液I (主要成分是蛋白酶K)组成；PCR扩增反应试剂包括dNTP (脱氧单核苷酸)UOXPCR缓冲液、MgC12、三蒸水和Taq酶(DNA聚合酶)，所述的引物序列外前向引物F: TGG CTC CTT TAA CCT CTC CA (SEQ ID NO.1)，外反向引物R: AAG GAT TAT GGA TGCGGT TG (SEQ ID NO. 2);内前向引物 F: ACG ACC AAC TCA TAC ACC TC (SEQ ID NO. 3)，内反向引物R: AGT ACG GGA AGG GTA TAA CC(SEQ ID NO. 4);限制性内切酶包括限制性内切酶I ;阳性标本对照是含有线粒体序列第4263位点发生A>G突变的酶切样本、阴性标本对照是不含有线粒体序列第4263位点发生A>G突变的酶切样本。在上述试剂盒中，在PCR扩增反应试剂中添加用于提高延伸反应特异性的少许二甲基亚砜(O. 1-0. 2 μ I为宜)` 本专利技术的另一个目的是提供所述试剂盒在检测与母系遗传原发性高血压相关的线粒体基因tRNA116 A4263G突变中的应用。通过以下步骤实现 (1)基因组DNA的提取运用蛋白酶K消化裂解法，从少量的血液标本、带毛囊的毛发、口腔粘膜刮片或唾液的样本中提取基因组DNA ； (2)特异性PCR扩增使用Primer5. O软件和01 igo7. O软件根据SEQ ID NO. 5所示的人类线粒体基因序列所设计的引物F#/R#、F#/Rdr增出包含上述原发性高血压的线粒体突变位点的片段，F#/R#卜扩增出为线粒体DNA的核苷酸3777-4679，其序列为序列表中的SEQ ID NO.1和SEQ ID NO. 2 ;F /R肖扩增出为线粒体DNA的核苷酸4151-4468，其序列为序列表中的 SEQ ID NO. 3 和 SEQ ID NO. 4 ； (3)酶切鉴定将上述PCR产物用限制性内切酶I对A4263G突变位点处进行酶切； (4)突变检测聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，直接根据酶切PCR产物产生的DNA片段数量及DNA片段大小，检测mtDNA是否发生A4263G突变。在上述检测mtDNA A4263G突变的方法中，可从血标本(如一滴血)、带毛囊的毛发、口腔粘膜刮片或唾液的样本中快速提取基因组DNA，根据取样方式或被测样本形式不同，对不同样本进行相应的预处理，处理方法如下(1)血标本(如一滴血)取20 200μ I少量血标本(如一滴血)或Icm2的血滤纸片放入1. 5ml EP管(离心管，Eppendorf管),加入900 μ I红细胞裂解缓冲液(20mmol/L三轻甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液，pH 7.6) (Tris-HCl缓冲液)室温静置lOmin，充分裂解红细胞，12000rpm离心lmin,收集白细胞沉淀； (2)带毛囊的毛发用本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种检测高血压相关的线粒体DNAA4263G突变的试剂盒，其特征在于，由盒体、引物序列、提取样本基因组DNA的试剂、PCR扩增反应试剂、阳性标本对照、阴性标本对照构成，其中，提取样本基因组DNA的试剂由细胞裂解液和溶液Ⅰ组成；PCR扩增反应试剂包括脱氧单核苷酸、10×PCR缓冲液、MgCl2、三蒸水和DNA聚合酶；所述的引物序列是：外前向引物F:?TGG?CTC?CTT?TAA?CCT?CTC?CA，外反向引物R:?AAG?GAT?TAT?GGA?TGC?GGT?TG；内前向引物F:?ACG?ACC?AAC?TCA?TAC?ACC?TC，内反向引物R:?AGT?ACG?GGA?AGG?GTA?TAA?CC；限制性内切酶为限制性内切酶StyⅠ；阳性标本对照是含有线粒体序列第4263位点发生A>G突变的酶切样本，阴性标本对照是不含有线粒体序列第4263位点发生A>G突变的酶切样本；所述溶液Ⅰ的主要成分是蛋白酶K。
【技术特征摘要】
1.一种检测高血压相关的线粒体DNAA4263G突变的试剂盒，其特征在于，由盒体、引物序列、提取样本基因组DNA的试剂、PCR扩增反应试剂、阳性标本对照、阴性标本对照构成，其中，提取样本基因组DNA的试剂由细胞裂解液和溶液I组成；PCR扩增反应试剂包括脱氧单核苷酸、IO X PCR缓冲液、MgCl 2、三蒸水和DNA聚合酶；所述的引物序列是外前向引物F:TGG CTC CTT TAA CCT CTC CA，外反向引物R: AAG GAT TAT GGA TGC GGT TG;内前向引物F: ACG ACC AAC TCA TAC ACC TC，内反向引物 R: AGT ACG GGA AGG GTA TAA CC;限制性内切酶为限制性内切酶况I ;阳性标本对照是含有线粒体序列第4263位点发生A>G突变的酶切样本，阴性标本对照是不含有线粒体序列第4263位点发生A>G突变的酶切样本；所述溶液I的主要成分是蛋白酶K。2.根据权利要求1所述的一种检测高血压相关的线粒体DNAA4263G突变的试剂盒，其特征在于，在PCR扩增反应试剂中添加O. 1-0. 2μ I 二甲基亚砜。3.根据权利要求1或2所述的试剂盒在检测与母系遗传原发性高血压相关的线粒体基因tRNAIleA4263G突变中的应用。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，通过以下步骤实现 (1)基因组DNA的提取运用蛋白酶K消化裂解法，从血液标本、带毛囊的毛发、口腔粘膜刮片或唾液的样本中提取基因组DNA ； (2)特异性PCR扩增使用Primer5. O软件和Oligo7. O软件根据SEQ ID NO. 5所示的人类线粒体基因序列所设计的引物F#/R#、F#/Rdr增出包含上述原发性高血压的线粒体突变位点的片段，F纟卜/R纟卜扩增出为线粒体DNA的核苷酸3777-4679，其序列SEQ ID NO.1和SEQ ID NO. 2增出为线粒体DNA的核苷酸4151-44...
【专利技术属性】
技术研发人员：管敏鑫，蒋萍萍，冀延春，肖云，刘浩，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：
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