一种提取植物DNA的方法及其专用试剂盒技术

本发明专利技术的目的是提供一种被称为mCTAB的植物DNA提取方法及其专用试剂盒。本发明专利技术所提供的试剂盒包括缓冲液A，所述缓冲液A由溶质及溶剂组成；所述溶质及其在所述缓冲液A中的终浓度如下：乙二胺四乙酸二钠4-6mmol·L-1，NaCl?0.2-0.3M，聚乙烯基吡咯烷酮1-3g/100ml；1M且pH8.0的Tris-HCl缓冲液8-12ml/100ml；所述溶剂为水。本发明专利技术的mCTAB法提取植物DNA具有产率高、质量较好、PCR扩增成功率高、成本低、通用性好五大优点，能满足一般分子生物学研究DNA提取的需要，特别适合科研经费不充裕的研究者和大批量植物DNA的提取。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种提取植物DNA的方法及其专用试剂盒。
技术介绍
DNA是植物的基本遗传物质，是植物遗传信息的载体。一定量及高质量的DNA样品是进行限制性酶切、PCR扩增、分子杂交、遗传多态性分析以及基因组学等分子生物学研究的基础。因此，如何获取一定量及高质量的DNA样品显得极为重要。植物细胞有细胞壁，含有较多的多糖等次生代谢物，而且不同植物中次生代谢产 物的种类和含量差异很大，有时同种植物不同器官或组织的此生代谢物的种类和含量也不一样，导致获取高质量的DNA有一定的难度。针对某种特殊物种优化的DNA提取方法不一定适用于其他物种。传统CTAB法是目前应用最多的DNA提取方法，但由于植物材料化学成分、组织结构等差异，传统的CTAB法的提取效果有时欠佳，在使用上受到一定的限制。因此迫切需要一种简便、高效、经济且通用性较好的植物DNA提取方法。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供一种提取植物DNA的方法及其专用试剂盒。本专利技术所提供的用于提取植物DNA的试剂盒，包括缓冲液A ;所述缓冲液A由溶质及溶剂组成；所述溶质及其在所述缓冲液A中的终浓度如下乙二胺四乙酸二钠4-6mmol L' NaCl 0. 2-0. 3M，聚乙烯基吡咯烷酮l_3g/100ml ;浓度为IM且pH为8. 0的Tris-HCl缓冲液8-12ml/100ml ;所述溶剂为水。上述试剂盒中还可包括缓冲液B ;所述缓冲液B由溶质及溶剂组成所述溶质及其在所述缓冲液B中的终浓度如下浓度为IM且pH为8. 0的Tris-HCl缓冲液8-12ml/100ml，乙二胺四乙酸二钠 20-30mmol I71，NaCl I. 2-1. 6M, CTAB2. 5-3. 5g/100ml，偏亚硫酸氢钠0.5-1. 5g/100ml，抗坏血酸钠0. 5-1. 5g/100ml，聚乙烯基吡咯烷酮l_3g/100ml, 3 -巯基乙醇80-120ul/100ml ;所述溶剂为水。上述任一所述试剂盒中，所述缓冲液A具体可为如下所述溶质及其在所述缓冲液A中的终浓度如下乙二胺四乙酸二钠5mmol L' NaCl 0. 25M，聚乙烯基吡咯烷酮2g/100ml ;浓度为 IM 且 pH 为 8. 0 的 Tris-HCl 缓冲液 lOml/lOOml ；上述任一所述试剂盒中，所述缓冲液B具体可为如下所述溶质及其在所述缓冲液B中的终浓度如下浓度为IM且pH为8. 0的Tris-HCl缓冲液10ml/100ml，乙二胺四乙酸二钠 25mmol I71, NaCl I. 4M, CTAB 3g/100ml,偏亚硫酸氢钠 lg/100ml,抗坏血酸钠lg/100ml，聚乙烯基吡咯烷酮2g/100ml，P -巯基乙醇100ul/100ml。本专利技术所提供的提取植物DNA的方法，包括如下步骤(I)将缓冲液A与植物组织粉末混匀，冰浴，离心，弃上清，收集沉淀；(2)将缓冲液B与步骤(I)所得沉淀混匀，放置，离心，收集上清液；(3)用氯仿异戊醇溶液从步骤(2)中所得上清液中提取DNA，再进行去RNA及沉淀DNA的步骤，得到目的DNA ；所述缓冲液A和所述缓冲液B均为上述任一所述试剂盒中的缓冲液A和缓冲液B。上述方法中，所述步骤(I)中，冰浴的时间为10min-20min。上述方法中，所述步骤(2)中，所述放置的方法为60°C -70°C水浴90-120min，具体为 65°C水浴 IOOmin。上述方法中，在所述步骤⑴之后，所述步骤⑵之前，还包括如下重复步骤将上一步骤所得沉淀与所述缓冲液A混匀，冰浴，离心，弃上清，收集沉淀；直到上清不粘稠。 上述方法中，所述步骤(I)中，所述缓冲液A与植物组织粉末的配比为ImL缓冲液A :20mg植物组织粉末；所述冰浴过程中颠倒混勻2-3次；所述离心为7000 Xg离心IOmin ；所述冰浴的时间为15min ；上述方法中，所述步骤(2)中，所述缓冲液B与所述植物组织粉末的配比为0. 7mL缓冲液B 20mg植物组织粉末；所述水浴过程中颠倒混匀数次；所述离心为IOOOOXg离心IOmin0上述方法中，所述步骤(3)中，所述用氯仿异戊醇溶液从步骤(2)中所得上清液中提取DNA的方法如下向步骤(2)所得上清液中加入0. 7mL氯仿异戊醇溶液，颠倒混匀10min，10000Xg，离心lOmin，收集上清；氯仿异戊醇溶液中氯仿异戊醇的体积比为24 I;重复上述氯仿异戊醇步骤，直到离心后两个液面之间没有沉淀；然后加入0.5mL异丙醇，混匀，_20°C放置20min，10000Xg，离心lOmin，弃上清；上述方法中，所述步骤(3)中，所述去RNA的方法包括如下步骤加入0. ImL的浓度为 IOOmg L-1 的 RNase 溶液，37°C放置 30_60min ;加入 0. ImL 去离子水、0. lmL5MNaCl 溶液,0. 8mL 95%无水乙醇,混勻，IOOOOXg离心IOmin,弃上清；上述方法中，所述步骤(3)中，所述沉淀DNA的方法如下加入0. 5mL 75%乙醇水溶液，弹起沉淀，10000 Xg,离心2min,弃上清。上述方法中，所述植物组织为植物叶片。上述方法中，所述植物为如下中的任一种短尖叶墙藓、荚果蕨、油松、二乔玉兰、葡萄、月季花、反枝苋、美丽向日葵、箬竹、西藏虎头兰。本专利技术的mCTAB法提取植物DNA具有产率高、质量较好、PCR扩增成功率高、成本低、通用性好五大优点，能满足一般分子生物学研究DNA提取的需要，特别适合科研经费不充裕的研究者和大批量植物DNA的提取。附图说明图I为用五种方法提取的10种植物的DNA琼脂糖凝胶电泳检测结果。入DNA的浓度从左到右分别为10ng、25ng和50ng。编号1-10为样品编号(同表I)。I、II、III和IV分别代表四个公司的DNA提取试剂盒。图2为用五种方法提取的10种植物的DNA扩增四种DNA条形码常用片段的情况。引物情况A. rbcLaf/r ；B. trnH/psbA ；C. matK472F/1248R ；D. ITS1/ITS4。编号 1-10 为样品编号(同表I) ；MD为mCTAB ;1、II、III和IV分别代表四个公司的DNA提取试剂盒。具体实施方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下述各实施例及对比例中使用的原料如下选取10种常见植物(表I)，分别作为苔藓植物、蕨类植物、裸子植物、基部被子植物、单子叶植物、蔷薇类植物、菊类植物等各大分枝(APG 111,2009)的代表。这10种植物同时包含了乔木、灌木、藤本、多年生草本、一年生草本等不同的生长习性，有代表性。植物样品均采自中国科学院植物研究所植物园，数字影像信息及凭证标本存放于中国科学院植物研究所标本馆(PE)。采集该10种植物材料的新鲜叶片，40 V烘干后用硅胶保存备用。表I 用于对比研究的材料。本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于提取植物DNA的试剂盒，其特征在于试剂盒包括缓冲液A ； 所述缓冲液A由溶质及溶剂组成；所述溶质及其在所述缓冲液A中的终浓度如下乙二胺四乙酸二钠4-6mmol L4，NaCl 0. 2-0. 3M，聚乙烯基吡咯烷酮l_3g/100ml ;浓度为IM且pH为8. 0的Tris-HCl缓冲液8_12ml/100ml ;所述溶剂为水。2.根据权利要求I所述的试剂盒，其特征在于所述试剂盒中还包括缓冲液B;所述缓冲液B由溶质及溶剂组成所述溶质及其在所述缓冲液B中的终浓度如下浓度为IM 且 pH 为 8. 0 的 Tris-HCl 缓冲液 8_12ml/100ml,乙二胺四乙酸二钠 20_30mmol I71，NaCl I. 2-1. 6M, CTAB 2. 5-3. 5g/100ml,偏亚硫酸氢钠 0. 5-1. 5g/100ml,抗坏血酸钠0. 5-1. 5g/100ml，聚乙烯基吡咯烷酮l-3g/100ml，P -巯基乙醇80_120ul/100ml ;所述溶剂为水。3.根据权利要求I或2所述的试剂盒，其特征在于所述缓冲液A中，所述溶质及其在所述缓冲液A中的终浓度如下乙二胺四乙酸二钠5mmol L' NaCl 0. 25M，聚乙烯基 吡咯烷酮 2g/100ml ;浓度为 IM 且 pH 为 8. 0 的 Tris-HCl 缓冲液 lOml/lOOml ； 所述缓冲液B中，所述溶质及其在所述缓冲液B中的终浓度如下浓度为IM且pH为8.0 的 Tris-HCl 缓冲液 10ml/100ml,乙二胺四乙酸二钠 25mmol L' NaCl I. 4M, CTAB3g/100ml，偏亚硫酸氢钠lg/100ml，抗坏血酸钠lg/100ml，聚乙烯基吡咯烷酮2g/100ml，3 -巯基乙醇 100ul/100ml。4.一种提取植物DNA的方法，包括如下步骤 (1)将缓冲液A与植物组织粉末混匀，冰浴，离心，弃上清，收集沉淀； (2)将缓冲液B与步骤(I)所得沉淀混匀，放置，离心，收集上清液； (3)用氯仿异戊醇溶液从步骤(2)中所得上清液中提取DNA，再进行去RNA及沉淀DNA的步骤，得到目的DNA; 所述缓冲液A和...

【专利技术属性】
技术研发人员：周世良，李金璐，于婧，王硕，
申请(专利权)人：中国科学院植物研究所，
类型：发明
国别省市：