香蕉穿孔线虫LAMP特异性检测方法技术

本发明专利技术涉及香蕉穿孔线虫(Radopholus?similis)分子检测，属于植物检疫领域。本发明专利技术基于香蕉穿孔线虫与其相近种序列存在差异，通过比对香蕉穿孔线虫与其相近种线虫序列差异性，设计了1组特异引物(6条)。同时，本发明专利技术提供了一组检测香蕉穿孔线虫的LAMP引物组序列，还进一步提供了检测香蕉穿孔线虫的检测方法。本发明专利技术的引物特异性好，检测方法快速简单，准确性高，为香蕉穿孔线虫疫情监测及香蕉穿孔线虫病防控提供了有效的技术保障。

【技术实现步骤摘要】
香蕉穿孔线虫LAMP特异性检测方法—.
本专利技术适用于香蕉穿孔线虫检测，属生物
二.
技术介绍
香蕉穿孔线虫(Radopholus similis)是国际公认的对农林业为害最重的十大植物寄生线虫之一。该线虫寄主范围广，多达250余种；为害重，对香蕉、柑橘及黑胡椒等造成毁灭性的危害；地理分布广，在世界一百多个国家和地区有分布。该线虫被包括中国在内全世界三十多个国家及区域组织列为重要检疫性有害生物。近几年，该线虫在我国局部地区的温室和大棚的观赏植物上被发现，可能是随着观赏植物的引进传入，尽管及时发现并得到有效控制，但该线虫严重威胁我国农林业生产安全。因此，加强对该线虫的监测、检疫防控，阻止其进一步传入，至关重要。香蕉穿孔线虫属线虫门(Nematoda)、侧尾腺纲(Secernentea)、垫刃目 (Tylenchida)、短体线虫科(Pratylenchidae)、穿孔线虫属(Radopholus)。该线虫的传统分类鉴定主要依据形态学特征辅以测计学数据。因此该线虫的准确鉴定需要工作人员丰富的工作经验，故难以满足植物检疫工作的实际需要。随着PCR等分子生物学技术发展及推广，越来越多的分子检测技术运用到植物有害生物检测技术中，近年来香蕉穿孔线虫种特异性PCR(Polymerase Chain Reaction,聚合酶链式反应)等检测技术不断出现，但是这些基于PCR的检测技术都需要PCR仪等昂贵设备，难以用于现场检疫，以及在一些基层监测工作中应用。三.
技术实现思路
本专利技术目的是提供一种香蕉穿孔线虫环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification)快速检测方法。运用环介导等温扩增技术检测香蕉穿孔线虫的方法，能够提高检测效率和检测的准确度，本专利技术针对香蕉穿孔线虫核糖体DNA的ITS2 区8个区域设计I组引物(含6条特异引物)，具有特异性高、快速等优点。检测时间只需 25-30分钟。此外，该检测方法简单，不需复杂设备，因此还可用于室外监测及一线口岸现场检疫。四.技术方案(I)香蕉穿孔线虫DNA提取取线虫，置于PCR管中，液氮放置2分钟，加入1μ I蛋白酶K(lmg/ml)，65°C 15分钟，95°C以上水处理10分钟，所得即为线虫DNA提取液；(2)香蕉穿孔线虫LAMP检测特异引物Rs-3F3 5' -GACTTGATGAGCGCAGAC-3'Rs-3B3 5' -ACGCATTCATGTACGCAT-3'Rs-3FIP 5' -AGCTGGCTGCGTTCTTCATACAAGAATTCTAGCCTTATCGG-3'Rs-3BIP 5' -CGAATGCACATTGCGCCATTGTTAACGACCCTGAACCAG-3'RS-3LF 5' -TACGAGCCGAGTGATCCA-3'Rs-3LB 5' -GAGTCACTTCCTCTGGCAC-3'(3)香蕉穿孔线虫浊度观察检测反应体系PCR管中加入下列试剂，使总反应体积为20 ill :本文档来自技高网...

【技术保护点】
一组香蕉穿孔线虫LAMP检测用特异引物，其核苷酸序列为：?Rs?3F3：5′?GACTTGATGAGCGCAGAC?3′?Rs?3B3：5′?ACGCATTCATGTACGCAT?3′?Rs?3FIP：5′?AGCTGGCTGCGTTCTTCATACAAGAATTCTAGCCTTATCGG?3′?Rs?3BIP：5′?CGAATGCACATTGCGCCATTGTTAACGACCCTGAACCAG?3′?Rs?3LF：5′?TACGAGCCGAGTGATCCA?3′?Rs?3LB：5′?GAGTCACTTCCTCTGGCAC?3′?。

【技术特征摘要】
1.一组香蕉穿孔线虫LAMP检测用特异引物，其核苷酸序列为Rs-3F3 5' -GACTTGATGAGCGCAGAC-3'Rs-3B3 5/ -ACGCATTCATGTACGCAT-3'Rs-3FIP 5/ -AGCTGGCTGCGTTCTTCATACAAGAATTCTAGCCTTATCGG-3'Rs-3BIP 5/ -CGAATGCACATTGCGCCATTGTTAACGACCCTGAACCAG-3/Rs-3LF 5/ -TACGAGCCGAGTGATCCA-3' Rs-3LB 5/ -GAGTCACTTCCTCTGGCAC-3'。2.一种...

【专利技术属性】
技术研发人员：熊玉芬，葛建军，王旭，
申请(专利权)人：中国检验检疫科学研究院，
类型：发明
国别省市：