本发明专利技术公开了日本短体线虫的PCR检测试剂及试剂盒，包括一对特异性引物，上游引物的核苷酸序列：GGCAACGGGCCTAGTTATGA，下游引物的核苷酸序列：GACTCGCGCACACGATAAAC。该特异性引物对苹果根结线虫特异、灵敏，扩增的特异性片段大小为176bp，对其它短体线虫无特异性条带片段；应用本发明专利技术的特异性引物及试剂盒，可在4小时内完成测试，灵敏度高，实用性强。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及短体属线虫的检测技术，具体涉及日本短体线虫的PCR检测试剂及试剂盒。
技术介绍
短体属线虫（Pratylenchus Filipjev，1936）为植物根系专性内寄生线虫，是植物病原线虫中种类最多、分布最广、为害最严重的类群之一，具有十分重要的经济意义。我国于2007年将短体线虫（非中国种）列入《中华人民共和国进境植物检疫性有害生物名录》，在口岸实施严格检疫，以保护我国农业和生态安全。日本短体线虫Pratylenchus japonicus Ryss,1988为宁波口岸首次从来自日本的鸡爪槭中截获。国内尚无分布，为非中国种，是我国进境植物检疫性有害生物。日本短体线虫在1963年首次由日本的Gotoh和Ohshima提到，当时只鉴定到短体属，1974年Gotoh又将这个种归于穿孔属，1982年Minagawa将该种鉴定为大针短体线虫Pratylenchus macrostylus Wu,1971。1988年，俄罗斯学者Ryss将在日本发现的该种线虫与加拿大发现的大针短体线虫进行区分，把它描述为新的亚种P.macrostylus japonicus,Ryss,1988。直到1997年，日本的Mizukubo等根据形态学特征、测计值及分子生物学特征，将其与大针短体线虫区分开来，并将其从亚种提升到种，命名为日本短体线虫。日本短体线虫仅发现于日本，我国尚未有相关报道。其寄主包括栎属的扁果麻栎、槲树、枹栎以及苹果、枇杷、>矮樱桃等几种果树，可以对寄主造成侵染，影响寄主植物的生长。我国口岸出入境检疫实验室或其他相关部门，都面临着对短体线虫进行快速、准确的鉴定这一难题。近年来，虽然在形态学鉴定的基础上，PCR－RFLP、荧光PCR、特异性PCR、序列测定、LAMP技术等已在线虫鉴定上广泛应用，但在短体线虫上应用很少。目前还未公开日本短体线虫的分子生物学方面的检测报道。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种快速、特异、准确的日本短体线虫的PCR检测试剂及试剂盒。本专利技术系选择参考GenBank中日本短体线虫的核糖体28S基因（Internal Transcribed Spacer），使用Primer Explorer V4（http://primerexplorer.jp）设计了特异性引物，经过大量的反应条件优选、对比试验和验证试验，并经过大量实际样品的检测应用评估（以日本短体线虫的DNA为模板，穿刺短体线虫、咖啡短体线虫、伤残短体线虫、卢斯短体线虫为阴性对照，水为空白对照，利用引物进行PCR检测。通过观察扩增产物的保守性和特异性，筛选最适引物），筛选得到扩增效率和特异性好的一对特异性引物。引物均由上海英潍捷基生物技术有限公司合成。本专利技术的日本短体线虫的PCR检测试剂，包括一对特异性引物，所述一对特异性引物的核苷酸序列分别为：上游引物：5’-GGCAACGGGC CTAGTTATGA-3’下游引物：5’-GACTCGCGCA CACGATAAAC-3’。日本短体线虫的PCR检测试剂盒，由无Mg2+的10×PCR缓冲液，浓度为25mM的MgCl2溶液，浓度为0.1mM的dNTP溶液，浓度5U/μL的Taq酶溶液，浓度都为10μM的上游引物溶液和下游引物溶液组成。与现有技术相比，本专利技术的优点是日本短体线虫的PCR检测试剂及试剂盒，包括一对特异性引物，上游引物的核苷酸序列：GGCAACGGGC CTAGTTATGA，下游引物的核苷酸序列：GACTCGCGCA CACGATAAAC。该特异性引物对日本短体线虫特异、灵敏，扩增的特异性片段大小为176bp，对其它短体线虫无特异性条带片段；应用本专利技术的特异性引物及试剂盒，可在4小时内完成检测，灵敏度高，实用性强。具体实施方式以下结合实施例对本专利技术作进一步详细描述。实施例1、日本短体线虫的PCR检测试剂盒100次或200次反应体系，50μL反应体系包括：无Mg2+的10×PCR缓冲液5.0μL，浓度为25mM的MgCl2溶液5.0μL，浓度为0.1mM的dNTP溶液4.0μL，浓度5U/μL的Taq酶溶液0.6μL，浓度都为10μM的上游引物溶液和下游引物溶液各3.0μL。Taq酶液，dNTP液购于宝生物工程（大连）有限公司，其中上游引物溶液含有核苷酸序列为GGCAACGGGC CTAGTTATGA的引物，下游引物溶液含有核苷酸序列为GACTCGCGCACACGATAAAC引物。实施例2、DNA提取方法挑取单条线虫放入200μL PCR管中[已加有10μL双蒸水和5μL10×PCR缓冲液（无Mg2+）]，液氮中放置1min（或-70度放置0.5h）以上，取出后立即85℃加热2min。然后向PCR管中加入1μL1mg/mL蛋白酶K，56℃加热30min以上，95℃加热10min，得到DNA模板。实施例3、PCR检测方法用日本短体线虫的PCR检测试剂盒进行检测，PCR反应体系为：无Mg2+的10×PCR缓冲液5.0μL，浓度为25mM的MgCl2溶液5.0μL，浓度为0.1mM的dNTP溶液4.0μL，浓度5U/μL的Taq酶溶液0.6μL，浓度都为10μM的上游引物溶液和下游引物溶液各3.0μL，DNA模板1.0～5.0μL，ddH2O补齐50μL。PCR反应条件：94℃预变性3min；94℃变性30S，55℃退火30S，72℃延伸30S，共35个循环；最后一个循环结束后，72℃延伸6min。电泳：将5μL PCR产物用1.0％（重量/体积）琼脂糖凝胶电泳分离，经DNA染料染色后于紫外凝胶成像系统下显像，出现特异性片段大小为176bp，则为日本短体线虫。实施例4、日本短体线虫的特异性和敏感性试验用实施例2的提取方法，实施例3的PCR检测方法，分别对日本短体线虫（采自日本进口的鸡爪槭）、卢斯短体线虫（采自日本进口的山茶）、咖啡短体线虫（采自宁波的大豆）、伤残短体线虫（采自日本进口的鸡爪槭）、朱顶红短体线虫（采自以色列进口的孤挺花）、玻利维亚短体线虫（采自新西兰进口的麻）、假草地短体线虫（采自俄罗斯进口的郁金香）和最短尾短体线虫（采自台湾进口的苗）进行检测，只有日本短体线虫能进行有效扩增，出现条带，且其特异性片段大小为176bp，说明本专利技术一对引物具有很好的特异性。对日本短体线虫的DNA模板进行100、10﹣1、10﹣2、10﹣3、10﹣4、10﹣5、10﹣6稀释再PCR检测，结果显示PCR检测限为原液稀释10-1倍。<110>宁本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.日本短体线虫的PCR检测试剂，包括一对特异性引物，其特征在于一对特异性
引物的核苷酸序列分别为：
上游引物：GGCAACGGGC CTAGTTATGA
下游引物：GACTCGCGCA CACGATAAAC。
2.如权利要求1所述的日本...
【专利技术属性】
技术研发人员：顾建锋，何洁，陈先锋，
申请(专利权)人：宁波检验检疫科学技术研究院，
类型：发明
国别省市：
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