本发明专利技术提供一种革兰阳性菌的实时荧光定量PCR检测试剂盒，由革兰阳性菌DNA抽提液、定量PCR反应液、标准品、阳性对照品、阴性对照品、说明书和盒体组成，其中定量PCR反应液含有PCR缓冲液、MgCl2、dNTPs、耐热DNA聚合酶、上游扩增引物、下游扩增引物和革兰阳性菌荧光探针。本发明专利技术以革兰阳性菌16SrRNA基因为靶基因开发的实时荧光定量PCR试剂盒，能简便、快速、通用检测所有革兰阳性菌，并能对检测结果阳性的革兰阳性菌进行准确定量，提高了革兰阳性菌鉴定检测的通用性和敏感性，可为临床所有革兰阳性菌感染的早期诊断提供依据。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属生物
，涉及荧光定量PCR检测试剂盒，具体涉及一种实时荧光定量PCR检测患者血液、脑脊液、胸水、腹水等样本中革兰阳性菌的诊断试剂盒。
技术介绍
革兰阳性菌是社区和医院感染的重要病原菌。近年来，革兰阳性菌感染呈逐年增多趋势，如院内获得性败血症等感染性疾病的病原菌中革兰阳性菌逐渐占据主导地位。随着抗生素广泛、不合理的应用，对多种抗生素耐药的革兰阳性菌也迅速增加，如耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）、耐青霉素肺炎链球菌（PRSP）、耐万古霉素肠球菌（VRE）等。对革兰阳性菌作出早期、准确的检测鉴定，能及时为临床医生提供可靠的病原学信息，对患者合理的抗菌治疗、减少耐药株的发生具有重要意义。目前临床诊断革兰阳性菌感染的方法包括血常规、C反应蛋白、血培养、病灶分泌物涂片及培养、病原菌抗原或抗体检测等，但存在需时长、易污染、阳性率低、特异性差、不能定量等缺点，无法满足临床早期、快速、准确诊断革兰阳性菌感染的需要。随着分子生物学技术的迅速发展，聚合酶链反应（polymerase chain reaction,PCR）技术，特别是近几年兴起的实时荧光定量PCR技术为病原微生物的检测提供了新方向。实时荧光定量PCR技术的基本原理是利用Taq酶的5’-3’外切酶核酸活性，在普通PCR基础上设计荧光双标记探针，两端分别标记荧光报告基团（R）和淬灭基团（Q）；探针保持完整时R基团的荧光信号被Q基团抑制，一旦探针被切断，Q基团的抑制作用消失，R基团的荧光信号就可被检测到。该技术通过对荧光信号的检测实现对PCR过程中产物量的实时监测，并可精确计算初始模板量，除具有定量准确、检测快速等优点外，最大的优势是采用完全闭管检测，省去了对PCR产物的后处理，避免了交叉污染。细菌16S rRNA基因是细菌染色体上编码rRNA相对应的DNA序列，该基因具有两大特点：⑴多拷贝：16S rRNA基因以3－7个拷贝的多拷贝形式存在于所有细菌染色体基因组中，使得对该基因的检测具有较高的敏感性；⑵多信息：16S rRNA基因由可变区和保守区组成，保守区为所有细菌共有，可变区可用于不同细菌的分型。目前几乎所有病原菌的16S rRNA基因测序已经完成，选择16S rRNA基因作为细菌基因分类的靶序列正逐渐成为细菌鉴别、分类的金标准。本专利技术基于上述研究背景，以革兰阳性菌16S rRNA基因中的共同保守序列设计PCR扩增引物和荧光探针，开发了能用于所有革兰阳性菌检测的实时荧光定量PCR试剂盒。该试剂盒不仅能针对性地检测所有的革兰阳性菌，而且能对感染的革兰阳性菌进行准确定量，具有简便、快捷、高效等特点，适用于临床所有革兰阳性菌感染的早期、快速诊断。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种革兰阳性菌的实时荧光定量PCR检测试剂盒，由革兰阳性菌DNA抽提液、定量PCR反应液、标准品、阳性对照品、阴性对照品、说明书和盒体组成，其中定量PCR反应液含有PCR缓冲液、MgCl2、dNTPs、耐热DNA聚合酶、上游扩增引物、下游扩增引物和革兰阳性菌荧光探针。PCR扩增引物序列为：上游扩增引物（SEQ ID No：1）：5’-CAACGCGAAGAACCTTACC-3’；下游扩增引物（SEQ ID No：2）：5’-ACGTCATCCCCACCTTCC-3’。荧光探针和荧光标记物为：革兰阳性菌荧光探针（SEQ ID No：3）：5’-FAM-TGACGACAACCATGCACCACC-BHQ-1-3’。标准品序列为（SEQ ID No：4）：CAACGCGAAG AACCTTACCA AATCTTGACA TC CTTTGACA ACTCTAGAGA TAGAGCCTTC CTCTTCGGGG GACAAAGTGA CAGGTGG TGC ATGGTTGTCG TCAGCTCGTG TCGTGAGATG TTGGGTTAAG TCCCGCAACG AG CGCAACCC TTAAGCTTAG TTGCCATCAT TAAGTTGGGC ACTCTAAGTT GACTGCC GGT GACAAACCGG AGGAAGGTGG GGATGACGT。革兰阳性菌DNA抽提液含有10mmol/L Tri-HCl、5mmol/L乙二胺四乙酸二钠（pH7.6）和0.5%十二烷基硫酸钠。阳性对照品为金黄色葡萄球菌灭活DNA样品，阴性对照品为无菌注射用水样品。本专利技术试剂盒应保存于-20℃，尽量减少反复冻融。本专利技术试剂盒使用方法：每次检测均应设立阳性对照和阴性对照，标准品用无菌去离子水稀释为1×102－1×109拷贝/ml。革兰阳性菌DNA的提取：采集新鲜全血1ml置枸橼酸钠抗凝的无菌真空采血管中，混匀后取全血50μl加等量DNA抽提液置100℃煮沸10分钟，12000转/分离心5分钟，取5μl上清作为PCR模板。细菌培养液、脑脊液、胸水、腹水等样本中革兰阳性菌DNA的提取方法同上。PCR扩增检测：在荧光定量PCR仪上进行，每个PCR反应体系总体积为50μl，其中包括45μl PCR反应液和5μl模板（提取的革兰阳性菌DNA、标准品、阳性或阴性对照）。PCR反应条件：94℃5分钟预变性，94℃20秒→60℃60秒，共40个循环。设置完成后，保存文件，运行程序。荧光定量结果报告：①检测样品的扩增曲线无对数增长期或CT（threshold cycle，每个反应管内的荧光信号达到设定域值所需的循环数）值≥40为革兰阳性菌阴性；②检测样品CT值≤35且扩增曲线有明显对数增长期为革兰阳性菌阳性；③检测样品35＜CT值＜40，需对样品重新进行DNA提取和PCR检测。根据标准曲线，计算各样品中的革兰阳性菌数量（拷贝/ml）。本专利技术以革兰阳性菌16S rRNA基因为靶基因开发的实时荧光定量PCR试剂盒，能简便、快速、通用检测所有革兰阳性菌，并能对检测结果阳性的革兰阳性菌进行准确定量，提高了革兰阳性菌鉴定检测的通用性和敏感性，可为临床所有革兰阳性菌感染的早期诊断提供依据。附图说明图1为本专利技术试剂盒的结构示意图。图2为标准菌株金黄色葡萄球菌片段序列。具体实施方式本专利技术结合实施例和附图作进一步说明。应该理解，这些实施例仅用于说明目的，而不用于限制本专利技术的范围。实施例1参见图1，本专利技术提供的革兰阳性菌实时荧光定量PCR检测试剂盒，由革兰阳性菌DNA抽提液（1）、定量PCR反应液（2）、标准品（3）、阳性对照品（4）、阴性对照品（5）、说明书（6）和盒体（7）组成，定量PCR本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种革兰阳性菌实时荧光定量PCR检测试剂盒，由革兰阳性菌DNA抽提液（1）、定量PCR反应液（2）、标准品（3）、阳性对照品（4）、阴性对照品（5）、说明书（6）和盒体（7）组成，定量PCR反应液单管分装，矩阵排列，其中定量PCR反应液含有PCR缓冲液、MgCl2、dNTPs、耐热DNA聚合酶、上游扩增引物、下游扩增引物和革兰阳性菌荧光探针；
PCR扩增引物序列为：
上游扩增引物：5’-CAACGCGAAGAACCTTACC-3’；
下游扩增引物：5’-ACGTCATCCCCACCTTCC-3’；
革兰阳性菌荧光探针：5’-FAM-TGACGACAACCATGCACCACC-BHQ-1-3’；
标准品序列为：CAACGCGAAG AACCTTACCA AATCTTGACA TCCTTTGACA ACTCTAGAGA TAGAGCCTTC CTCTTCGGGG GACAAAGTGA CAGGTGG...
【专利技术属性】
技术研发人员：杜立中，尚世强，舒强，陶然，李伟，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：
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